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(無題) 削除/引用 No.3797-16 - 2011/01/19 (水) 12:05:06 - gs86 Eireさま ご回答ありがとうございます。 とりあえず、ORFと3'UTRから適当に4−5種類プローブを作ってみようと思っています(mRNAが全長５Kbpほどあるので）。まずはホールマウントに挑戦です。 また、温度設定の情報についても参考にいたします。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3797-15 - 2011/01/18 (火) 22:33:51 - Eire 亀レスですが....... ホールマウントとパラフィン切片のどちらが簡便かについては、初期胚（E10.5-E11.5くらいまででしょうか）だと、ホールマウントの方が胚の前処理も簡単だし胚も小さくてプローブが浸透しやすいので楽だと思います。切片についてはパラフィンよりも凍結切片の方が感度が高いという人もいます。また、凍結方法についても固定後スクロース置換して凍結するよりも未固定新鮮凍結したほうが感度が良い、という人もいます。 プローブについてですが、ホールマウントだと私の経験では長いプローブでも特異的なパターンを検出できました。1-1.5kb あっても問題になったことは全くありません。直線化したテンプレートインサート入りプラスミドから in vitro transription で作製した DIG ラベル RNA プローブです。切片（固定後凍結切片）の場合は digestion した方が良いシグナルを得られました。ただ、これも長くても問題ない、という人もいます。プローブにする領域ですが、私はあまり深く考えず、ORF の 3'-end と 3'UTR のはじめの部分にかかる領域を大抵の遺伝子の場合使っていました。よほど塩基配列レベルで相同性が高いパラログを持つ遺伝子なら別だとは思いますが、私の場合はそういう遺伝子を検出する必要はなかったので、上記のような感じで領域を選んでいました。 ハイブリおよびハイブリ後の洗いの温度は65度でおこなっていました。ずいぶんと高い温度だと思われるかもしれませんが、ハイブリするものは70-72度くらい上げてもしっかりハイブリします。

(無題) 削除/引用 No.3797-14 - 2011/01/18 (火) 08:28:06 - gs86 すみません。先ほどの投稿は私です。名前を間違えました。。。

(無題) 削除/引用 No.3797-13 - 2011/01/18 (火) 08:27:05 - ge86 AAさま、APさま、 さらなるご回答ありがとうございます。 お二人のやり取りにもさらに納得でした。

(無題) 削除/引用 No.3797-12 - 2011/01/17 (月) 17:33:08 - AA >AP様 たしかに切片標本上で検出する際には2コピーしかないgDNAの影響は殆どないように私も思います。 私自身としてはエクソンジャンクションをまたぐ利点はプローブ作成時にあると思っています。 もちろんcDNAの品質はきちんと整えるべきなのですが、万が一、cDNAにgDNAが入っていたとしてもエクソンジャンクションをまたぐように設計しておけば変な物が出来上がることは少ないと思います。

(無題) 削除/引用 No.3797-11 - 2011/01/17 (月) 12:13:34 - AP ちょっと引っかかったのですが、 >genomicへの結合に対してはエクソンジャンクションをまたぐようにして設計することで対応しています。 これって、意味あるんでしょうか。 ゲノムDNA上の標的は、2コピーから多くて4コピー（遺伝子増幅を起こしている場合や、rRNAなどのrepetitive geneをのぞく）で、しかも核に局在します。cytosolにあり、一般的にコピー数がはるかに多いmRNA標的を検出するとき、仮にゲノムDNA上の標的にシグナルが出たとして、実際に問題になることはあるのでしょうか。 なによりも、染色体ISH（FISHなど）でゲノム上のユニーク配列を検出するのは、RNA ISHにはないそれなりの手技が必要であるし（クロマチンからの脱タンパク質、クロマチンDNAの変性処理など）、それを狙ってやろうとしてもなかなか難しいものですが。

(無題) 削除/引用 No.3797-10 - 2011/01/17 (月) 11:18:14 - AA ＞＞かすいぶんかいして、200〜500bpくらいにしているということでしょうか。 いいえ、そのままハイブリしています。 長いときはmRNAフルサイズのプローブを使ったことがありますが問題はありませんでした。（2kbaseくらいだったとおもいます)

(無題) 削除/引用 No.3797-9 - 2011/01/14 (金) 11:28:56 - gs86 APさま 蛇足だなんてとんでもないです。こういった背景はなかなか知る機会が少ないのでとても為になります。 AAさま ご回答ありがとうございます。 AA様の場合はかすいぶんかいして、200〜500bpくらいにしているということでしょうか。エクソンジャンクションをまたぐというのはいい考えですね。参考にさせていただきます。 また、パラフィンセクション作製時のRNAseについては確かに気になります。これまた経験ないのですが、凍結切片もできるようにしないといけないかもですね。 お二人ともありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3797-8 - 2011/01/13 (木) 15:38:39 - AA プローブの設計についてはAP様が既に説明をされていますのであまり触れる必要はないと思いますが、私自身は特異度が上がるように200〜500bpくらいの長さで作っています。（ロシュのDIG標識キット使用） genomicへの結合に対してはエクソンジャンクションをまたぐようにして設計することで対応しています。 私は普段凍結切片で行っています。パラフィンでのin situをお考えとのことですが、パラフィンの場合、通常共通で使用するパラフィン化の系列はRNaseのことを考慮していないと思いますのでRNase free gradeで用意するのが多少手間になるかと思います。 ホールマウントは私自身はやったことがないので細かいことは言えないのですが経験者の先輩にきくと、切片と比較しても手間は大して違わないとのことでした。

(無題) 削除/引用 No.3797-7 - 2011/01/13 (木) 11:51:05 - AP 蛇足になりますが、 今では、多くの生物種でゲノム配列情報が整備されたり、シークエンス解析も手軽に出来るようになっていますから、まずシークエンス情報ありきで実験計画を考えてしまいますけれど、ほんの一昔前くらいまではそうではなかったんです。 そういうころからの常道ですが、あるクローニングされたDNA断片をWalkingやNorthernなどのプローブとして使おうと言うとき、まずそのプローブでGenomic Southernをしてクロスハイブリするようなrepetitive sequenceが含まれていないかとうかを確認するのは、現在でも通用するconventionalな進め方です。 そうすることで、そのクローンがゲノム構造を反映したものであるか（キメラや欠失などartificialな配列であることはまれではない）を確認できるとともに、repetitive sequenceを含んでいるかいないかを知ることが出来ます。検出されたバンドがユニークではなく、ラダー状になるときは、サブクローニングしてユニークな部分を使うようにします。

(無題) 削除/引用 No.3797-6 - 2011/01/12 (水) 23:37:27 - gs86 APさま たびたびご回答ありがとうございます。 プローブが長いと特異性が下がるというのはクロスハイブリが起こりやすくなるのではという意味で書きました。言葉が不適切であったならすみませんでした。 > 長くすることで、転写されるリピート配列を含んでしまうような時は当てはまりますが、必ずしもそうなるとは限らないし、あなたの言う > >alignment scoreが<40のもの、40-50のものがそれぞれいくつか出てきました。 > これくらいのホモロジーでクロスハイブリなんてまず起こらないと思いますけどまあ、それはNorthernでuniqueな産物を検出するかやってみるのが一番。 まさにこの点がよくわからない部分なわけです。RNA ISHは抗体を使用した免疫染色なんかに比べると実験のステップが多くてトラブルシュートが大変そうなのでできるだけ事前にいろいろ知っておきたいという気持ちがありました。が、おっしゃられるようにとにかくまず一度思うようにやってみてからトラブルシュートしていきたいと思います。良くも悪くも結果がなければ次に進みませんものね。 気になっている点については大部分教えていただけた気がします。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3797-5 - 2011/01/12 (水) 13:00:24 - AP >長すぎると特異度が下がるし、短すぎると感度が悪くなるというのはわかります。 この言い分のロジックがよく理解できません（長いと特異性が下がるって？） 長くすることで、転写されるリピート配列を含んでしまうような時は当てはまりますが、必ずしもそうなるとは限らないし、あなたの言う >alignment scoreが<40のもの、40-50のものがそれぞれいくつか出てきました。 これくらいのホモロジーでクロスハイブリなんてまず起こらないと思いますけどまあ、それはNorthernでuniqueな産物を検出するかやってみるのが一番。 それと、初めての実験を前に下調べや準備を十分しておくというのは偉いですが、実際にやってもいないうちに、あんまり頭でっかちにならないほうがいいですよ

(無題) 削除/引用 No.3797-4 - 2011/01/12 (水) 12:44:27 - AP >３　私の場合、100bpちょっとの特異的な部分を（クローニングしたベクターから）プローブにするほうが、600bpから加水分解して平均150bpのプローブを作製するよりも、blastnの結果から判断される配列の特異度という点で優れている気がします。この理解で正しいでしょうか。あるいは、長い配列から加水分解で様々な長さのプローブを作製することに特別な利点があるのでしょうか。たとえばまったくの想像ですが、mRNAの2次構造などにプローブのアクセスが影響を受けるかもしれないから、長めにカバーしておいたほうがいいとかあるのでしょうか。 ふつう、標識UTPと非標識UTPに対してある比率（1:3〜1:20)で混ぜて、内部標識をするわけです。プローブ全長が長くなれば、それだけ多くの標識が入ります。したがってcoverageが大きいほど、一コピーの標的RNAに対して多くの標識が着き感度が上がることが期待できます。 いっぽう、標識UTPの濃度が高いほど、RNAプローブの伸長性が下がります。長いプローブだと完全長に伸ばすために標識UTPの濃度を下げなければならないことがあり、そうすると一分子当たりの比活性が低くなります。 そのへんはトレードオフになりますが、要は、同じ標識UTP濃度で、伸長性に大きな影響がないなら、長いプローブの方が一コピーの標的RNAあたりの標識が増えるという単純な話でした。 もちろん、標的RNAがどれくらい豊富に存在するかで、必要最小限の感度は変わってくるでしょう。でも、一般的にある遺伝子を発現している細胞を検出しようと言うときに、細胞当たり細胞当たり数個コピーのRNAしかないものを相手にするというのでなければ、それほど気にしなくても良い（全長100 ntのプローブだからダメというわけではない）と思います。 >４　一般に、加水分解した後のプローブの平均長は、ゲルに流してスメアを見たりすることで確認するのでしょうか。毎回確認が必要だとするとちょっと面倒ですし、そうでなければ毎回同じような平均鎖長のプローブができているのか、つまり同じように反応してくれるのか不安になります。 電気泳動なんてルーチンワークですからそんなに面倒だとは思いませんが。ただ、EtBrで検出できるほど泳動するのはもったいないので、ナイロン膜にブロットして、anti-DIG-APで検出するのがいいです。 ご存じかと思いますが、いちおうRNAプローブのアルカリ水解のkineticsは　Cox et al.(1984) で報告されていて、現在でも多くの手引き書で引用されています。 http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6WDG-4DMW85M-94&_user=119230&_coverDate=02%2F29%2F1984&_rdoc=23&_fmt=high&_orig=browse&_origin=browse&_zone=rslt_list_item&_srch=doc-info(%23toc%236766%231984%23998989997%23524922%23FLA%23display%23Volume)&_cdi=6766&_sort=d&_docanchor=&view=c&_ct=28&_acct=C000009380&_version=1&_urlVersion=0&_userid=119230&md5=cf2ce2ddcbfc6254938f3da3cf82747e&searchtype=a オリジナルの鎖長Lo (kb)のRNAを、50 mM 炭酸ナトリウムバッファー (pH 10.2)中で60℃で処理したとき、断片化したRNAの平均鎖長がLf (kb) となる処理時間t (min) t=(Lo - Lf)/(0.11 x Lo x Lf)

(無題) 削除/引用 No.3797-3 - 2011/01/12 (水) 06:32:27 - gs86 APさま ご回答ありがとうございます。 さらに質問で申し訳ないのですが、 ３　私の場合、100bpちょっとの特異的な部分を（クローニングしたベクターから）プローブにするほうが、600bpから加水分解して平均150bpのプローブを作製するよりも、blastnの結果から判断される配列の特異度という点で優れている気がします。この理解で正しいでしょうか。あるいは、長い配列から加水分解で様々な長さのプローブを作製することに特別な利点があるのでしょうか。たとえばまったくの想像ですが、mRNAの2次構造などにプローブのアクセスが影響を受けるかもしれないから、長めにカバーしておいたほうがいいとかあるのでしょうか。 ４　一般に、加水分解した後のプローブの平均長は、ゲルに流してスメアを見たりすることで確認するのでしょうか。毎回確認が必要だとするとちょっと面倒ですし、そうでなければ毎回同じような平均鎖長のプローブができているのか、つまり同じように反応してくれるのか不安になります。 また、Northenの件は大変参考になりました。 以上よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.3797-2 - 2011/01/11 (火) 13:17:28 - AP 1. IVTで標識する場合、伸長性、収量は配列にかなり依存します。 あまり長くしても伸長しきらない鎖がたくさん出来てしまったりして、実際に使っているプローブがどんなものであるかをコントロールしきれないということになります。なので300 bp以下、長くても500 bp以下が確実だと思います。 プローブのcoverage (全長）が長いほど感度を稼げるのは当然ですが、多くの場合それくらいの長さで十分です。もしうんとcoverageを大きくしたいなら、区間をいくつかに分けて合成したRNAプローブを混合するという方法もあります。 プローブの浸透性、非特異的吸着の排除などの面から、プローブの平均長は300 bp以下、あるいは150 bp乃至100 bp以下が良いとされています。これは150 bpのRNAプローブを合成して使用しろということでは必ずしもなくて、たとえば500 bp長で合成したRNAプローブをアルカリ性の炭酸バッファー中で加水分解して平均鎖長が150 bpになるようにして使えばいいのです。 どのくらいの平均長が最適であるかは、文献によって、あるいは材料、前処理方法、ハイブリの条件などによっても違います。単純にホールマウントかパラフィンセクションで、どうこうとは一概には言えないと思います。まず、平均的なプローブ長でやってみて検出できればよし、不十分なら他の条件を最適化していくのが良いと思います（プローブ長のコントロールはそれほど自由になりませんので）。 2. 実際に合成したプローブでNorthern blotをやってみるということをおすすめします。データベース上ホモロジーからで予測しても個々の実験で実際にどうなるかわかりません。時には、coding RNAに対するプローブがnon-coding RNAとクロスハイブリして検出されることだってあります。そのプローブが標的RNAを検出できて、それ以外は検出しないということをNorthernで確かめてから使うべきです。

RNA in situ　のプローブ設計 削除/引用 No.3797-1 - 2011/01/11 (火) 07:27:47 - gs86 いつも勉強させていただいてます。 RNA in situ hybridizationの系を立ち上げようと思っています。 おもなサンプルはマウス胎仔で、検出はDIGを考えています。 Rocheの DIG RNA Labeling Kit がよさそうかなぁを現時点で漠然と思っています。 対象となる遺伝子には市販の抗体はありませんが、RT-ｑPCR, microarray data baseなどで大体の発現パターンはわかっています。 RNA in situ のプローブ設計経験がないのでたくさん疑問があるのですが、 1 プローブの長さはどれくらいが適当でしょうか、長すぎると特異度が下がるし、短すぎると感度が悪くなるというのはわかります。またパラフィンセクションとwhole mountを考えていますが、どちらが技術的に簡単(?) ですか、また、それによってプローブのデザインを変える（特に長さという点において）必要がありますか？ 2 設計した配列をNCBIのblastnにかけて特異性をみるということでよろしいでしょうか？その場合、どれくらいまでの相同性なら許容してよいでしょうか。ためしに600nt位で1回やってみたところ、alignment scoreが<40のもの、40-50のものがそれぞれいくつか出てきました。もしこれらをすべて許容できないとすると、100％特異的な部分は100ntくらいになってしまいます。ただひとつよくわからないのは、NT_、NW_で始まるものばかりですべてgenomic contigとなっていました。これは何なんでしょう？mRNAじゃないから無視していいのか、genomeに相同性の高い配列があればやはりbackgroundを気にしないといけないのか？） 反応温度やwashでどれくらいまでカバーできるのか、経験がなくよくわからないため、経験のある方のご意見を伺いたいです。また、皆さんご使用の試薬やweb siteでお薦めがあれば教えてください！

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