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(無題) 削除/引用 No.3782-8 - 2011/01/07 (金) 22:10:43 - Actias 「タンパク質を抽出し」っていうのがどういう操作か知りませんが。 培養から発現誘導まで、経時的に培地（大腸菌けん濁液）をとり、SDS-PAGEのサンプルバッファーを入れて、ボイル後そのまま泳動すると、どうでしょうか？大腸菌に入っている蛋白質にできるだけ手をくわえずそのまま泳動してっていうことです。 T7の系が使えるなら、無細胞系の転写／蛋白質合成ではどうでしょう？ 上記のココロは、「いつそうなるの？」

(無題) 削除/引用 No.3782-7 - 2011/01/07 (金) 22:03:17 - Actias Re: No.3782-6 そういう質問とか、宿主を変えたらいいのかとか、培養温度を変えたらいいかとか、誘導試薬の濃度を変えたらいいかとか、「やってみたらうまくいった」からそれが原因だった、っていう、レトロスコピックなところが有るので、なんともいえません。 このトピ、 「私の抱えているこの問題を解決してください」 よりは、 「似たような事例をたくさん教えてください」 の方が近いかも。 メルク／ノバジェンのカタログに宿主がたくさん載っているので、検討してみては？ 塩基配列をいじるよりは、かんたん。 Re: No.3782-3 ノートを見直すと、full-length １７０アミノ酸のときは短いのはでてなかったけど、GST-[1-135]というおしりを短くしたときにほとんどGST と同じ長さの物が出ていました。 この場合だと、「使用頻度の低いコドンの影響」は考えにくいですね。

(無題) 削除/引用 No.3782-6 - 2011/01/06 (木) 23:19:58 - mamosan GSTタグのC末と目的遺伝子のN末の間には、大腸菌で仕様頻度の少ないコドン が二つ存在していたのですが、そういうのも目的タンパク質が発現しないの と関係しているのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3782-5 - 2011/01/06 (木) 23:10:50 - mamosan ＞んんのさん GST抗体を使用したウエスタンブロットで確認しました。

(無題) 削除/引用 No.3782-4 - 2011/01/06 (木) 22:47:33 - おお 不溶かくぶんに、ものがいっているとか、、、

(無題) 削除/引用 No.3782-3 - 2011/01/06 (木) 21:42:54 - Actias 回答ではないですが。 「配列確認もしているのに、GST しか発現していないのはどういうことか？」 皆さんが疑問に思うことでしょうが、僕の場合も有りました。 もっとも、よくよくSDS-PAGE のCBB 染色像をみると、GST よりほんの少しだけ泳動が遅かったです。 たまには目的の大きさのものも取れました（C末モノクロ抗体でウエスタンをすると見えたので)。 そこから考えると、完全長が合成されているにもかかわらず、できたタンパクが切られているような感じです。 残念なことですが、切られているなら、発現させた大腸菌粗精製物のウエスタンをC末抗体で見れば、泳動の早いところに見えるはずですが、そこまで突っ込んだ見方をしませんでしたので、そういうシグナルが有ったかどうか、わかりません。 【おまけのはなし】 そのGST-tagのほぼGSTの大きさのタンパクを前任者がエイヤっで免疫してモノクロ抗体をとりました。 His-tagの全長タンパクには反応しませんでした。N末ちょこっとのところがエピトープになってくれていれば、使えたのに。 GST-tagの全長タンパクにも反応しませんでした。 で、コントロールのGSTのみにも反応しませんでした。カラム精製したので、GSTで免疫したのと同じと思ってましたが、そうではなかったです。 結局、そのモノクロ抗体で検出できたのは、GST-tagが付いたGSTよりちょこっと遅いタンパク、つまり、大腸菌合成途中で切れたタンパク、想像ではその切り口に反応したようです。

(無題) 削除/引用 No.3782-2 - 2011/01/06 (木) 19:56:04 - ンンノ 目的タンパク質をコードしている遺伝子を挿入した発現プラスミドを導入したに も関わらずGSTした出来ていないということですか？ GSTのみという確認の方法は？

大腸菌でのタンパク質発現 削除/引用 No.3782-1 - 2011/01/06 (木) 19:18:18 - mamosan 現在、タンパク質発現用ベクター（pGEX-4T-3）に目的遺伝子をサブクローニングし、大腸菌Origamiに形質転換を行い、タンパク質を大量発現させています。 タンパク質を抽出し、SDS-PAGE、ウエスタン、を行って発現の確認をしましたが、GSTタグしか発現していません。 このような場合、目的タンパク質が発現しないのは、どのようなことが考えられるでしょうか？（目的遺伝子はしっかりサブクローニングされていることは確認済みです。） 他の宿主（BL21）でも同じ結果でした。

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