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神経幹細胞での分化率の評価 トピック削除
No.3763-TOPIC - 2011/01/03 (月) 05:01:48 - 神経幹細胞
現在、薬物に対する神経幹細胞の分化率の変化を評価しています。
免疫染色にてニューロンへの分化率が５−１０％増加することを確認しました。これを確かめるためにウエスタンブロットを行っているのですが、ほとんど変化が認められません。なぜこのような事が起こるのでしょうか？
薬物処理後でも細胞の７０％くらいが未分化な状態です。これが原因なのでしょうか？
また、このような評価を別の方法（ＦＡＣＳ）等は無いのでしょうか？
　
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No.3763-9 - 2011/01/04 (火) 12:54:59 - 神経幹細胞
ありがとうございます。

FACSの技師と相談して試してみます。

(無題) 削除/引用
No.3763-8 - 2011/01/04 (火) 05:45:31 - Boston-Pullman
私は神経幹細胞の研究者でないので、FACS（フローサイトメトリーも含め）の条件については具体的なアドバイスはできません。

ただ、FACS core facilityの技師が分化した神経細胞のサンプルを直前に流していたから、条件を戻さないとねといっていました。

100umの細胞をキャッチできるようにパラメーターをいじったといっていました。あと流速を弱めないと神経突起が切れてしまうと。

特異的な抗体があるのであれば、フローサイトメトリーなり、FACSで解析可能です。

(無題) 削除/引用
No.3763-7 - 2011/01/04 (火) 05:05:53 - 神経幹細胞
ありがとうございます。
ウエスタンで20uLと22uLで確かめてみます。

神経細胞をＦＡＣＳすることは可能でしょうか？現在、分化後のニューロンのマーカーに軸索のみが染色されるマーカーを使っています。

(無題) 削除/引用
No.3763-6 - 2011/01/04 (火) 04:26:18 - Boston-Pullman
薬物を加えていない比較対象のサンプルを２０uLつかってウェスタンしたとします。

となりのレーンに同じサンプルを２２uLながしてウェスタンをしたとき、２０uLのレーンと比較して、差が検出できますか？

それができなければ、ウェスタンでは評価できません。ELISAなら可能かもしれません。

ご自身でも書いておられますが、FACSで評価できるのであれば、それに越したことはないと思います。

(無題) 削除/引用
No.3763-5 - 2011/01/03 (月) 23:01:51 - 神経幹細胞
レスありがとうございます。情報が少なくてすみません。

細胞は、ラットまたはマウス胎児由来の初代培養です。

培養法はＦＧＦを添加しニューロスフェア法で培養し、回収した神経幹細胞をＦＧＦなしで培養し分化させます。この際、薬物を添加しています。

ニューロンマーカーを用いたウエスタンブロットです。

ポジコンに用いたものと比較して分化率は同等です。ポジコンでも１０％くらい分化率が増加します。

薬物処理は７日間で、未分化な細胞はネスチンで染色して評価しました。


ＩＰで濃縮とありますが、どのようにするのでしょうか？

5-10％も差をウエスタンで検出するのは難しいとのご指摘ですが、ほかに証明する方法はないのでしょうか？

よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用
No.3763-4 - 2011/01/03 (月) 16:15:17 - ンンノ
ウェスタンでは検出感度以上のターゲットが含まれていても、それが純品でなく
含有割合が少ないと検出できないことがよくあります。
メンブレンにブロットする際に他のタンパク質と競合して負けるとか、たぶん
そんな理由ではないかと思ってます。

IPで濃縮すればウェスタンでも見えることがあります。

(無題) 削除/引用
No.3763-3 - 2011/01/03 (月) 15:27:54 - おお
5から10%ってウエスタンは相当慎重にしないと難しいかもしれません。。。

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No.3763-2 - 2011/01/03 (月) 11:21:12 - dec
@ヒト由来ですか？マウス由来ですか？それとも他の種の細胞ですか？初代培養ですか？ES細胞由来ですか？
A培養法は何ですか？培地は？添加因子は？
B何に対する抗体を用いた免疫染色＆ウエスタンブロットですか？
Cポジコンとなる化合物を添加した場合との比較はどうですか？
D薬物処理後何時間置きましたか？未分化性はどのように評価しましたか？

最低限この程度は記載していただかないと、誰もコメントできないと思います。

神経幹細胞での分化率の評価 削除/引用
No.3763-1 - 2011/01/03 (月) 05:01:48 - 神経幹細胞
現在、薬物に対する神経幹細胞の分化率の変化を評価しています。
免疫染色にてニューロンへの分化率が５−１０％増加することを確認しました。これを確かめるためにウエスタンブロットを行っているのですが、ほとんど変化が認められません。なぜこのような事が起こるのでしょうか？
薬物処理後でも細胞の７０％くらいが未分化な状態です。これが原因なのでしょうか？
また、このような評価を別の方法（ＦＡＣＳ）等は無いのでしょうか？
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