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(無題) 削除/引用 No.3758-5 - 2011/01/08 (土) 10:19:10 - 310 ami様、おお様、　ご教示いただきありがとうございました。 primeStarHSが届きました。今、他の実験で手が離せないですが、来週にはLA-Taqと比較実験（増えるかどうかのレベルですが）ができると思います。結果が出ましたら、ご報告しようと思っております。

(無題) 削除/引用 No.3758-4 - 2011/01/04 (火) 04:29:59 - 310 お返事送れて申し訳ありません。 ami様 >PrimeSTAR HS Takaraのwebを見ました。GCバッファの添加をしても、なお高いfidelityでしたので、ボスに相談した後、注文をしようと思っています。 おお様 >配列は情報がないっていう話ですよね。 primer付近は分かります場所により100bp単位のGC比が780%程度まで上がります。また増幅領域に超可変部位があって、これは配列が確定するまで不明です。 シークエンスを委託していたときには、半分ほどがMixCloneだと言われていましたが、自分でシーケンスし始めてから1個もMixCloneのデータはありません。単にコロニーのピックアップの問題かもしれませんが、過去に委託先でのベタイン添加で改善した例もあり、今使ってるシーケンスキットがGCに強いといわれるBigDyeVer.3.1であったりもするので、PCRでもなるべくGC比に影響されにくいポリメラーゼを使おうと思っています。

(無題) 削除/引用 No.3758-3 - 2010/12/31 (金) 13:51:02 - おお 配列は情報がないっていう話ですよね。

(無題) 削除/引用 No.3758-2 - 2010/12/30 (木) 22:24:00 - ami PrimeSTAR HS

DNA鎖合成速度と正確性 削除/引用 No.3758-1 - 2010/12/30 (木) 22:15:24 - 310 フリーザーの事故でダメージを受けている細胞からRNAを抽出しほぼ完全長（といっても1.4kbですが）のｃDNAをクローニングし、発現ベクターまたはウイルスで別の細胞にトランスフェクションすると言う実験を行っています。 他のラボからの頼まれ仕事で、細胞を増やすことも、新規のサンプルをもらうことも不可能です。 過去の5'RACEの過程でMupid Blueを用いて観察した限りは、ほぼ低分子の中にごく薄いスメアの目的分子長らしきものが見えていました。おそらく全長をカバーできるRNA分子の割合は少ないと思い、5'RACEで参考にした1細胞からのRNA増幅をした（BioTechniques 40:469-478 (April 2006)）の条件でmRNAほぼ全長のPCRクローニングを行いました。 とにかく増やすことだけ考えてしまっていたため、LA-TaqのGC-bufferによるfidelityの低下をよく考えませんでした。多くのPCRによる変異（200bpに一つ）が出た後にTAKARAのサポートで、LA-TaqはGC-bufferを加えることにより、通常のTaq並にまでfidelityが下がる事を知り、またVolume 16 Number 21 1988 Nucleic Acids Researchで”普通のTaq”を用い8000bpで22の変異が観察された事も知りました。今回はコロニーをできるだけ多く取り、場合により制限酵素で切り貼りして何とかしようと考えていますが、次回の実験に使うポリメラーゼをどうしようか思案中です。 DNA鎖合成速度と正確性を兼ね備え、ターゲットの配列や構造に影響を受けにくく、プライマーをかじる心配なしに、高い特異性のアニーリングが期待できるような、ポリメラーゼをご存知でしたら教えていただけないでしょうか？クローニングはTAクローニングですが、+A付加操作を別途行いますのでブラントエンドでも大丈夫と思います。プライマーの特異性が守られ合成が正確なのが一番大事な点で、構造の問題はPromegaで見かけたfidelityを落としにくい変性剤や温度パラメータをいじって、何とかしようと考えています。 各社高い正確性のポリメラーゼを出していますが、どれがいいのか分かりません。ご助言よろしくお願いします。

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