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(無題) 削除/引用 No.3750-10 - 2010/12/30 (木) 23:56:48 - AP こういう問題は、ベクターの骨格（oriの種類やpromoterの種類）の情報が重要だと思うんですが。 それはさておき、思いつきですが、 >プライマーは上流はベクターにおいて、下流はインサートに置いています。実はこれでPCRをかけると何個か増幅できるのですが、 ならば、そのコロニーからベクターとインサートの継ぎ目を挟んでback-to-backのprimerでPCRをかけてligationで環状化してトランスフォ−メーションすることで、正しい向きのプラスミドをenrichすることはできないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3750-9 - 2010/12/30 (木) 09:25:11 - たろちゃん みなさんいろいろと助言ありがとうございます。 > ３０度で培養するとコロニーが見えるようになるまで時間がかかります。 > 培地組成にもよりますが経験的には２４時間経ってもまだ小さい感じ。 > 増殖に不利なプラスミドを持ってるクローンはなおさら小さいコロニーでしょう。 > > シーケンステンプレートはプラスミドDNAではないですか？ > コロニーPCRを鋳型にしたらアタリの配列かもしれません。 > そうなら液体培養してるあいだに、混ざってた逆向きのプラスミドが優勢に > なっちゃったんではないかと思います。 そうなんです。コロニーPCRでうまくいったものを培養してミニプレップしてシークエンスをかけました。 > コロニーPCRでポジティブだったコロニーの大腸菌をまだ捨てて（なくて古 > くなって）なければ、ストリークしてシングルコロニー単離をやり直してみ > れば、アタリが入ってるかも。 ありがとうございます。一度ポジティブのコロニーを培養して再度プレートに撒いてコロニーを単離してみるようにします。 いろんなやり方があるんですね。またちょっとやる気が出てきました。ありがとうございます。今後も勉強させてもらいます。

(無題) 削除/引用 No.3750-8 - 2010/12/30 (木) 08:37:40 - おお すいません小出しで、、、 逆のが取れているなら、それからフラグメントをEcoRIで切出し再ライゲーションというのもてです。メチレーションのちがいでPCRより効率が上がると思いますので有利に働く可能性があります。

(無題) 削除/引用 No.3750-7 - 2010/12/30 (木) 08:34:14 - おお 方向が定まるように設計するのが得策だと思います。 もし反対の方向に入ったプラスミドがBstXI CCANNNNNNTGG こんな感じの制限酵素で切断できるのなら、プラスミドやインサートにそういう配列がないという条件で、ライゲーション後にその酵素で切断してからトランスフォーメーションというても考えられます。最初からそういうプライマーの設定というのもあり得る選択ではあります。 現状でどうかしたいというのであれば、確実な方法ではありませんが、コロニーPCRで数を稼ぐ、30度ぐらいでプレートをインキュベーション、こうせい物質の濃度をさげる、大腸菌を代えてみるなどのコンビネーションで私ならやると思いますが、 もしフレームなどに影響がないなら、ブラントでの挿入もくわえてやってみると思います。そういう微妙な違いで取れたり取れなかったりというのは説明がつかないにしてもたまに経験しています。ブラントでいくなら、プラスミドを EcoRIかっとでブラントにして、PCRプロダクトをそのままかEcoRIカットのあとブラントにして、ライゲーション後セルフライゲーションを XmnI GAANNNNTTCで切断という手も取れるかもしれません。EcoRIをブラントにしてセルフライゲーションすると XmnIサイトが生じます。ほかの所にこのサイトがなければ有効な手段です。

(無題) 削除/引用 No.3750-6 - 2010/12/30 (木) 07:14:35 - ンンノ ３０度で培養するとコロニーが見えるようになるまで時間がかかります。 培地組成にもよりますが経験的には２４時間経ってもまだ小さい感じ。 増殖に不利なプラスミドを持ってるクローンはなおさら小さいコロニーでしょう。 シーケンステンプレートはプラスミドDNAではないですか？ コロニーPCRを鋳型にしたらアタリの配列かもしれません。 そうなら液体培養してるあいだに、混ざってた逆向きのプラスミドが優勢に なっちゃったんではないかと思います。 コロニーPCRでポジティブだったコロニーの大腸菌をまだ捨てて（なくて古 くなって）なければ、ストリークしてシングルコロニー単離をやり直してみ れば、アタリが入ってるかも。 ＃情報を小出しにされると回答を何度もつけないといけないから面倒です。

早速の返事ありがとうございます。 削除/引用 No.3750-4 - 2010/12/29 (水) 23:31:18 - たろちゃん 　早速の返事ありがとうございます。 　最初はランダムにピックアップしてシークエンスまで見ていたのですが、最近はコロニーPCRをかけるようにしています。 プライマーは上流はベクターにおいて、下流はインサートに置いています。実はこれでPCRをかけると何個か増幅できるのですが、シークエンスをかけると逆になっていました。まったく理由もわからず、（というかおそらくミスリーディング？positive controlもおいているので間違いないはずなのですが…）心折れそうになっております。 　ありがとうございます。一度大腸菌の菌の株を変えることを考えてみます。それでもだめなら、オリゴを入れてみます。 　ちなみにトランスフォーメーション後の培養温度を下げる方法というのは30℃でやっているのですが、おすすめの温度なんかあれば教えて下さい。

(無題) 削除/引用 No.3750-3 - 2010/12/29 (水) 22:20:58 - ンンノ 珍しいことではないと思います。 いつもは力技で済ましてます（苦笑） シーケンスしなくてもインサートの向きを知る方法を考えて沢山コロニーピック します。 コロニーは小さいのも拾うように心がけるといいです。 インサートの向きを調べるのはコロニーPCRでもいいし、制限酵素消化でも。 ホストの菌株を換えるのも有効です。 アダプターをかますのは最終手段でいいと思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.3750-2 - 2010/12/29 (水) 21:37:02 - やま EcoRIサイトにオリゴを貼り合わせてマルチクローニングサイト を入れてからやるのはどうでしょうか？

逆インサートについて 削除/引用 No.3750-1 - 2010/12/29 (水) 20:46:35 - たろちゃん 　いつも勉強させていただいております。 　どなたか助言をいただければありがたいのですが、 現在、900bpくらいの遺伝子をインサートとしてプラスミドに挿入してその発現を見る実験をしております。 　方法はインサートをEcoR1が両末端につくようにPCRで増やして、EcoR1処理をしました。そしてプラスミドもEcoR1で処理して1本化したのちBAPでセルフを防いでいます。この後ライゲーションしてトランスフォーメーションをしています。 　 　コロニーは40から50個くらいとれ、インサートも入っているのですが、シークエンスをかけるとすべて逆インサートです。おそらくインサートが大腸菌に嫌われている配列なのではないかと思います。 　そこで、大腸菌に毒性？のある入りにくい配列のインサート入れる方法おしえていただけないでしょうか？ 　トランスフォーメーション後の培養温度は37℃30℃の2通りを行いましたが同じでした。 　使用大腸菌はDH5αです。 double digestionをすればよいのでしょうが、使用しているプラスミドにはEcoR1サイトしかない状況です。他のプラスミドは理由があって使えない状況です。 　非常に困っております。よろしくお願いします。

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