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(無題) 削除/引用 No.3748-10 - 2011/01/06 (木) 20:26:26 - 白米 aji様 情報ありがとうございます。 ただ残念な事に私の研究室にはPfuやPfu turboがなく、GC rich対応ポリメラーゼの試供品も来週幾つか頂ける事になったのでそちらをまずは試してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.3748-9 - 2011/01/05 (水) 11:00:59 - aji 既に解決していたらいいのですが、幾つか。 このフォーラムではDMSOとベタインがよく書かれていますが、個人的にはグリセロール終濃度15%がGCリッチには安定して増えます。酵素はPfuかPfu turboで。Taqの類はグリセロール入れると酷くエラーが入ります。 温度も振ったということですが、最初の変性を98度5分、各サイクルの変性を98度1分とっみてください。それでダメならやはりGCリッチ対応のキットがいいかもしれません。

皆様ご返答ありがとうございます 削除/引用 No.3748-8 - 2010/12/30 (木) 12:50:55 - 白米 AA様、ami様 お勧めの酵素を教えて頂きありがとうございます。 やはり厳しいですか……。 おお様 >ひとSIRT1ってうちやったんじゃないかな、、、だれか。それも >たしかふつうのTaqで。。。 本当ですか！？　新たに何か判りましたら宜しくお願いします！！ >>可能だと思うのですが増幅出来なかった長さかつGC richなものも分割して >>PCRにかけるだけで増幅出来る様になるという事もあるのでしょうか？ > >こうきかれたらyesです。かかる可能性は高くなります。 >5'の300bpがGCリッチなら、5'から200bpくらいと残りにわけると GCリッチ >なところは短く効率があげれるし、解消されるかもしれません 回答ありがとうございます。 少々疑問に思ったのですがGC richな部位の間で分けて短くする方がそれよりも200bp〜400bp程度長くなるもののGC richな部位を挟んだ前後で分けるよりも増幅出来る可能性は高くなるのでしょうか？ Actias様 調べて頂きありがとうございます。ただ、実はヒトSIRT1のcDNAの入ったベクターを貰うあてがないわけではないのです。しかし、これが自分の実験の練習も兼ねている為ボスに許可を得にくい事と、GST融合タンパクを作成したいのでSIRT1のcDNAについている制限酵素用配列次第ですが結局PCRを行う必要が出てくる可能性が高い為何とか自分でクローニング出来ればと思い試みています。 shu-t様 >試薬が買えない状況だとしても代理店の人にお願いしてみたらいろいろな会社からPCR >用のDNAポリメラーゼの試供品がもらえたりしますよ。タカラとか東洋紡はもらえる確率が >高いです。メーカーのサイトでモニター募集をしていることもありますしね。 >PrimeSTARシリーズも試供品があったと思います。 諸事情により使えるかどうか分からない試薬の購入は厳しかったのですがなるほど、試供品は考えつきませんでした。早速（とはいっても年明けになりますが）試供品を頂き試してみたいと思います。貴重なご意見ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.3748-6 - 2010/12/30 (木) 00:41:21 - shu-t 試薬が買えない状況だとしても代理店の人にお願いしてみたらいろいろな会社からPCR用のDNAポリメラーゼの試供品がもらえたりしますよ。タカラとか東洋紡はもらえる確率が高いです。メーカーのサイトでモニター募集をしていることもありますしね。 当ラボでは難しいテンプレートの増幅の際にはKOD FXが活躍してます。これも最初は試供品をもらってから導入しました。ちなみにPrimeSTARシリーズも試供品があったと思います。

これはもう 削除/引用 No.3748-5 - 2010/12/29 (水) 22:58:36 - ami PrimeSTAR GXLにすがる一手じゃないかなぁ･･･1回買えばずっと使えるし、そうむちゃくちゃ高くないし。

(無題) 削除/引用 No.3748-4 - 2010/12/29 (水) 21:10:21 - Actias http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/BC012499? Ｄａｎａｆｏｒｍの検索で引っかかるので、たぶん販売しています。

(無題) 削除/引用 No.3748-3 - 2010/12/29 (水) 18:19:57 - おお ひとSIRT1ってうちやったんじゃないかな、、、だれか。それも たしかふつうのTaqで。。。 条件は当時のひとがいないから詳しくはわからないと思う。ベタインとかフォルムアミド使うひともいるね、GCリッチに。ベタインDMSOコンビネーションでつかうこともある。 >可能だと思うのですが増幅出来なかった長さかつGC richなものも分割してPCRにかけるだけで増幅出来る様になるという事もあるのでしょうか？ こうきかれたらyesです。かかる可能性は高くなります。 5'の300bpがGCリッチなら、5'から200bpくらいと残りにわけると GCリッチなところは短く効率があげれるし、解消されるかもしれません。 プラスミドDNAとか譲ってもらえるか、買うこともかんがえてみたら?

(無題) 削除/引用 No.3748-2 - 2010/12/29 (水) 17:42:49 - AA >>熱変性の温度を上げたりDMSOも試してもみましたがダメでした。 個人的な経験から申し上げますと、DMSOやMg濃度、アニーリングや変性の温度を検討してダメなときはもうその酵素ではダメだと思います。 私の場合はRNAプローブ作成の際のクローニングや、ダイレクトシークエンス用のPCR増幅でしたが、 タカラのExTaqやロシュのExpand High Fidelityを使用して駄目だったときに、キャンペーン期間中だったタカラのPrimeStar GXLを使用してみたら簡単に解決したことがあります。 価格的に250Uで定価\35,000と安くはないですが、 お使いのExTaq(\27,000)と比べるとそこまで違うこともないと思います。 GC rich用に揃えておくのも良いのではないでしょうか？

（5'末端がGC richである遺伝子）SIRT1のPCRについて 削除/引用 No.3748-1 - 2010/12/29 (水) 16:35:56 - 白米 いつもお世話になっています。 現在私はCDSが2300bp程度のヒトSIRT1をクローニングしようと分割せずに白血病細胞株K562のcDNAライブラリーをテンプレートとしてPCRをかけているのですが条件（解離温度やテンプレートの濃度、各ステップの時間にサイクル数の変更等）を変えても上手くいきません。 5'末端がGC rich（CDS全体ではGC含量約47%であるものの5'末端から300bpまでのGC含量は約82%、420bpまでのGC含量でも約78%）という事で熱変性の温度を上げたりDMSOも試してもみましたがダメでした。 マウスSirt1（ヒトSIRT1とのCDS相同性85%、CDS全体ではGC含量約49%であるものの5‘末端から300bpまでのGC含量は約82%、420bpまでのGC含量でも約80%）をクローニングした事がある方によればCDSを前半800bpと後半1.6kbpに２分割してクローニングし、後半はPfu ポリメラーゼで比較的容易にクローニング出来たものの前半はPfuやExTaqではどうしても増幅できなかったり、別の配列が増幅されてきたりしたので、Clontech Advantage GC-2 kit（GC rich配列用のポリメラーゼ）を用いたら増幅出来たそうです。しかし私の所属する研究室にはGC rich対応Kitがなく、出来れば研究室にある試薬で何とかしたいのが現状です。 もし、どなたかrTaq、ExTaq、またはエキスパンドロングテンプレートPCRシステムによってヒトSIRT1、または同程度の末端がGC richな遺伝子のPCRに成功した方がおられましたら条件や使用した試薬等を教えて頂けないでしょうか？ また、rTaq、ExTaq を用いたPCRで2300bp程度の増幅は変異が入るにせよ可能だと思うのですが増幅出来なかった長さかつGC richなものも分割してPCRにかけるだけで増幅出来る様になるという事もあるのでしょうか？ やはりGC rich対応Kitがなければ厳しいのでしたらボスを説得しなければならないので参考文献等ご存じでしたら教えて頂けると幸いです。 どうか宜しくお願い致します。

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