全8件 ( 1 〜 8 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.370-8 - 2009/04/23 (木) 05:27:57 - おお あ、そうそう確かにSP1をGCリッチで思いつきました。

(無題) 削除/引用 No.370-7 - 2009/04/23 (木) 05:26:34 - おお 配列はしっかり読んでください。 と書きながら、感触をつかむ実験を先行してやっても良いかなという 反対のことを書いておきます。 PCRベースで増やしたと思えますがどうでしょうか? 得られたクローンを一個だけ拾ったわけでないですよね。 複数あってその領域の配列がどれもきれいに読めてない ということだと思います。 他の配列が読めて正しいクローンを数個同時に実験して、 全部が同じなら、そこの領域はPCRエラーがないか、 あってもあまり重要でないということになります。 そういうデーターを各クローンインデベンデントにデーター が出せるようにしておいて、その間にそこの配列をよむか、 削ったものを作ってしまうといいかと思います。 制限酵素でうまく削れれば配列の決定はそれほど重要でないので、 削ったクローンと削ってないクローンでさがなければ、 削ったクローンから実験を始めていけば配列が確実 なもので実験をやっているわけですから公表には 問題がないはずです。 インデペンデントにというのは、どれかが正しい配列 出なかった場合、そのデーターを含めない方がいいという いみです。 でも気がついたと思いますが、最終的には配列が しっかりしたもので公表するということです。

(無題) 削除/引用 No.370-6 - 2009/04/22 (水) 17:55:03 - KC あべちゃんさん、小心者さん、pumpkinさん、レス有難うございます。 たしかに正確な実験のためには、シークエンスの確認は必要ですね。 あくまでpreliminaryとして、一度アッセイはやってみようと思います。その結果次第で、頂いたsuggestionを検討したいと思います。 既報で同じ領域を用いてレポーターアッセイをしているものがありましたが、この件に関して何のコメントもなかったので、大変勉強になりました。

(無題) 削除/引用 No.370-5 - 2009/04/22 (水) 16:59:48 - あべちゃん >[Re:3] 小心者さんは書きました : > えーと、それでは論文のMaterials and methodsにはどうお書きになるおつもりですか？ 送信するボタンを押す前に、おそらく反発を受けるだろうなと思っていました。 しかし、それはあえてレポーターアッセイ自身だけで、何か議論できないだろうという個人的な思いからでした。すみません。 小心者さんのおっしゃるとおり、そのまま論文にするなら、そのGCリッチ領域はどうしても読めませんでしたというコメントをつけるべきです。 そんな情けないことを書きたくないなら、今回のトピ主さんが注目した転写因子にとって（幸いにも）重要でない領域のGCリッチ部分を削ったレポーターベクターを作り直して、用いたらよいと思います。 レポーターベクターは簡便なので、ハイスループットなど色々とっかかりとして良いと思います。が、それだけで論文にまとめているものをみると、あまり意味を感じません。

(無題) 削除/引用 No.370-4 - 2009/04/22 (水) 16:06:31 - Pumpkin 実は、昔々deletion mutantを作製してのプロモーターアッセイをした時に、いくつかのmutantで(必要にかられて)異なる作製方法で作ったことがありました。プロモーターの増強・増減は予想下通りの結果が得られましたが、よく確認してみるとある方法で作ったmutantはATG前に3塩基余分な配列が付加されていました。結局、mutantを作り直してアッセイした経験があります（お恥ずかしい）。結果は変わりませんでしたが。 >シークエンス結果から確かなのですが、3’側にCGリッチな部分があり100%ミスマッチないかは確認できていません。 これを確かと呼ぶかどうかは個人の問題なのかもしれませんが、やはりきちんと配列を確認しておく方が良いのではないですか？GCリッチなところにはなんの転写因子結合配列が予見されていないのでしょうか？例えば、ヒトならGCリッチだとすぐに浮かぶのはSp1ファミリーとかでしょうか。ここにmutationが入れば致命的だと思いますが。 workするかどうかの観点についてはあべちゃんさんと同意見です。

(無題) 削除/引用 No.370-3 - 2009/04/22 (水) 15:03:42 - 小心者 えーと、それでは論文のMaterials and methodsにはどうお書きになるおつもりですか？

(無題) 削除/引用 No.370-2 - 2009/04/22 (水) 14:06:44 - あべちゃん その転写因子のcis-elementに変異を導入したものと比較し、十分に差が認められるのであれば、神経質にならなくても良いと思います。 言葉が悪いかもしれませんが、逆に、レポーターアッセイとは、その程度のアバウトな手法であり、その後にEMSAやChIPなどの実験も併せて行っていくのが良いと思います。

プロモーターアッセイ用プラスミドのシークエンス 削除/引用 No.370-1 - 2009/04/22 (水) 11:48:58 - KC ある遺伝子の発現調節を検討する目的で、pGL3.0にプロモーター領域をsubcloningしました。インサートが入っていることは制限酵素処理の泳動とシークエンス結果から確かなのですが、3’側にCGリッチな部分があり100%ミスマッチないかは確認できていません。 ここで質問ですが、プロモーターアッセイ用のプラスミドのシークエンスも、蛋白発現用と同様に厳密にシークエンスを確認する必要があるのでしょうか？勝手な印象では、転写因子が結合する部分にミスマッチがなければプロモーター活性が上がるので、数塩基のミスマッチではworkするのではないかと思うのですがいかがでしょうか？

全8件 ( 1 〜 8 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---