こんにちは。いつも参考にさせて頂いてます。
是非、アドバイスを頂ければと思います。
私は、現在、マウスの脊髄から、ミクログリアの分離を試みております。
よく、論文などで percoll による密度勾配法にしたがって、分離をしている
報告を見かけまして、まずはその方法に従っております。しかし、
なかなかうまくいかずに困っております。
具体的な条件は、マウスの脊髄を細断し、トリプシン処理した後、70 μM
セルストレーナーにてフィルトレーションし、75% percoll-PBS 溶液 (GE 社) にて
細胞懸濁液を作製します。それを最下層として、37% percoll-PBS 溶液および PBS を
重層して、4℃、1000 ×g, 25 分の遠心分離を行います。 論文などから参考にした
場合、75% percoll と 37% percoll の層の中間にミクログリアが凝集する層が確認できる
とのことでしたが、我々の実験ではまったく確認できず、 37% percoll と PBS 層の
中間くらいにミエリンと思われる白い大きな細胞（脂質？）の凝集層を確認しました。
一応、ミクログリアの凝集層と思われる場所を採取して、MACS システムを用いて、
CD11b のポジティブセレクションを行い、FACS で確認しましたが、やはり、
細胞はほとんど存在しておりませんでした。
Percoll による密度勾配法では温度、遠心速度など、いくつかの詳細な条件設定により
層形成の状態が大きく変わると聞いた事があります。
素人のような質問で大変恐縮ですが、どなたか、至適条件をご存知でしたらご教授
頂けませんか？また、それ以外にも、上記の手順でここが問題じゃないかという
意見がございましたら、是非ご指摘いただければと思います。
宜しくお願い致します。
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