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(無題) 削除/引用 No.3679-25 - 2010/12/16 (木) 13:54:17 - 310 院生時代は2本鎖の蛍光サイクルシーケンスなど手抜きせずに、M13ファージで一本鎖化してPEG沈してやるか、RIでやれと言われていました。 今は便利な時代ですが、鋳型の一本鎖化はPCR産物でも有効化と思います。 http://www.jpo.go.jp/shiryou/s_sonota/hyoujun_gijutsu/kakusan/0067.html 私はコロニーが大きくなる前に我慢できずとってしまい、発色法が失敗することが多かったので、一回だけLB-Ampプレートに植継して、そこからplasmidもコロニーPCRも両方やっています。シェイキングインキュベータは隣のラボの借り物なので、いつも多検体はできません。このため多検体の時は大体コロニーPCRでQiagenで精製しています。PlasmidもQiagenで精製してます。このレスで安い方法を教えてもらったので、カラムがなくなったら切り替えようかと思っています。 同じ配列で大体同じコピー数のplasmidとコロニーPCRを読むと、私の配列の場合plasmidの方がより薄いbig-Dyeで読めます。また配列の影響もコロニーPCRがより大きく受けます。配列の影響がどう出るかといいますと、途中から（時には最初から）複数の配列がコンタミしたように出ます。以前、外注先の人と話しあって、ベタインを入れてもらったところ、”コンタミ”に見えた波形が、きれいな波形に変わったことがあります。 今は、自分でシーケンス反応しますので、変性剤入りのうすめ液を自作していますが、おおむね良好です。 業者は儲けが大事ですから、ぎりぎりまでシーケンス反応液を薄めているはずです。PCR産物に変性剤を入れてもらうか、一本鎖にするかで、改善するかもしれません。どちらも多少の最適化が必要ですので、お手軽とはいきませんが、ルーチンワークになる仕事ならば、やってもいいかなと思います。 フェノクロを廃棄するシステムを安価で利用出来るなら、マニュアルのplasmidミニプレップは簡単なのでお勧めです。ただインサートによっては培養で躓くかも知れません。その時は吸光度系でバクテリアの増幅曲線を書いて飽和前に回収すると、いいですよ。

(無題) 削除/引用 No.3679-24 - 2010/12/15 (水) 22:27:57 - やま >ExoSAPは必要ありません。 と書いたのはAMpureで精製した時の場合です。 分かりづらかったようで申し訳ありません。 PCR反応後のチューブにAMpureを入れて 同じチューブ内で精製出来るので多サンプルの時も便利です。 ExoSAP-ITよりもコストがかかりません。 定価計算で一番高くて1サンプル50円程度です。 http://www.beckmancoulter.co.jp/product/product01/AMPure.html （磁気プレートがいるので初期投資はかかりますが）

(無題) 削除/引用 No.3679-23 - 2010/12/15 (水) 20:58:02 - ンンノ コロニーPCRで使うプライマーの配列と、シーケンス反応に使うプライマーの 配列を違うものにするのは有効ですよ。 多分受託業者もそうアドバイスをしてると思うんですが、誤解してませんか。

(無題) 削除/引用 No.3679-22 - 2010/12/15 (水) 19:35:37 - シロクマ ExoSAP精製だとPCR反応液がシークエンス反応へ持ち込まれるため、PCR酵素とシークエンス・キットの相性があるようです。 なので、PCR酵素か精製法を変えてみてはどうでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3679-21 - 2010/12/15 (水) 14:38:48 - AP >便乗質問すいません。ExoSAP使おうかなと思ってるのですが、サンプルあたりのコストっていくらくらいですか。 定価ベースで一サンプル\200と少々。ミニプレップのキットで一回分と同等か、それ以上というところ。 http://www.gelifesciences.co.jp/catalog/0574.asp ただし、スケールダウン、処理するPCR産物の量を減らすなどすれば、1サンプル当たりの使用量を1/10から1/20くらいまで減らすことができます。蛍光シークエンスも技術が進んで感度が良くなってきているので、フルスケールでサイクルシークエンス反応することもあまりないと思いますので、マニュアルどおりのスケールではtoo muchです。 >ExoSAPは必要ありません。 もちろんカラムなど、別の方法で精製するなら必要ないです（それはそれでコストがかかりますが）。ExoSAP-ITが有利なのは、サイクルシークエンス反応をする、まさにその1 tubeのなかで、あらかじめプライマー除去、フリーのヌクレオチドの除去ができることです。シークエンスベースのgenotypingをするときなど、サンプル数が多くて、カラムなんかかけるのはかなわん、ていう時には非常に助かります。

(無題) 削除/引用 No.3679-20 - 2010/12/15 (水) 05:39:54 - Boston-Pullman PCR productのsizeと、PCRのサイクル数はどのくらいですか？ せっかくシングルコロニーを取ってきているのに、colony PCR の際に変異が入ってしまっては意味がありません。Colony PCR はインサートチェックという位置づけとし見たほうがいいと思いますーはやく結果を知りたい人用の。 皆さんと同意見、キットなどに頼らずに、ミニプレップすることをお勧めします。

http:// 削除/引用 No.3679-19 - 2010/12/15 (水) 02:14:57 - TK-1 > RNase処理後にエタ沈かPEG沈すれば十分です。 RNaseもphenol、PEGもしません。それで別に大丈夫です。サンプルが多いときにシングルチューブでできるということでboil-prepもやっていましたが、それでもsequencingに困ったことはありません。 キットは使うものであって、キットに使われるというのは情けないことです。

便乗質問すいません 削除/引用 No.3679-18 - 2010/12/14 (火) 23:04:51 - ami 便乗質問すいません。ExoSAP使おうかなと思ってるのですが、サンプルあたりのコストっていくらくらいですか。

(無題) 削除/引用 No.3679-17 - 2010/12/14 (火) 21:52:34 - やま キットを使わないミニプレップで十分シークエンス出来るプラスミドが取れます。 コロニーPCRより全然お金がかかりません。 RNase処理後にエタ沈かPEG沈すれば十分です。 概要は http://www.nara-wu.ac.jp/bio/molbio/protocol/PlasmidAlkali_SDS.html この辺を見て下さい。 インサート確認もプラスミドの制限酵素カットで出来ます。 どうしてもPCR産物でやりたい時は うちではPCR産物をAMpureで精製しています。 綺麗にシークエンス出来ます。 ExoSAPは必要ありません。

(無題) 削除/引用 No.3679-16 - 2010/12/14 (火) 21:51:27 - TS APさんの言うとおり、キットがなくてもプレップできますね。 それに外注でシークエンス読むのに比べたら、ミニプレップキットははるかに安いのでは？　50プレップで7000-10000円くらい。 いちど、かかる経費を少し整理してみてはいかがでしょう？ どうしてもダイレクトシークエンスに固執するのであれば忘れてください。

(無題) 削除/引用 No.3679-15 - 2010/12/14 (火) 21:36:32 - AP >を予算の関係で多用できない事から そのわりに、ExoSAPit1みたいな高価な試薬を使っているし。

(無題) 削除/引用 No.3679-14 - 2010/12/14 (火) 21:30:30 - AP >上にも書きましたが、ミニプレップのキットを予算の関係で多用できない事から現在の流れになったのだと思います。プライマーの除去はExoSAPを用いています。 いやぁ、キットを使わなきゃまともにミニプレップできないという言い分が異常としか思えない。お金が無ければアルカリ/SDS法「でフェノール抽出省略でも十分（やったほうがいいですが）。基本です。 >プライマーは自分たちのラボ保有の物を混ぜて送付しています。 それでは、文句言えないです。

追加で申し訳ありません。 削除/引用 No.3679-13 - 2010/12/14 (火) 21:21:14 - デオキシリボ核酸 もしご存知の方が居ましたら 1.コロニーPCR産物を用いたDNAシーケンスの精度を上げる方法 2.安価な方法でDNAシーケンスサンプルを作成する方法 を教えていただけると助かります。 皆様がご指摘いただいたミニプレップキットを多用する方法は 現在所属のラボの予算だと厳しそうですので。。。

ご指摘ありがとうございます。 削除/引用 No.3679-11 - 2010/12/14 (火) 21:14:05 - デオキシリボ核酸 中年さん＞ ありがとうございます。やはり見えない断片でしょうか。 ^さん＞ 波形データは出ており、機械が解析した塩基配列を送ってきました。 実験系を言って波形データの乱れに関して質問してみたところ、プライマーの位置を変えることを提案されました。 やはりミニプレップによるプラスミド精製ですか。ありがとうございます。 Edyさん＞ ExoSAPという酵素処理をしたものをシーケンスサンプルとして送っています。 外注する際は、増幅に用いたプライマーとPCR産物を指定濃度に希釈して混ぜて送っています。 TSさん＞ 研究室のプロトコールとして、コロニ−PCR産物を用いてシーケンスを行っています。 コロニーPCRおよびシーケンスに用いるプライマーの変更を提案されました。 お金の無いラボで、ミニプレップのキットを沢山使えない事から現在の手法になったのだと思います。 APさん＞ 上にも書きましたが、ミニプレップのキットを予算の関係で多用できない事から現在の流れになったのだと思います。プライマーの除去はExoSAPを用いています。 プライマーは自分たちのラボ保有の物を混ぜて送付しています。

(無題) 削除/引用 No.3679-10 - 2010/12/14 (火) 18:00:19 - AP 皆さんおっしゃるとおり、プラスミドにクローニングしているのだから、プラスミドを精製してシークエンスの鋳型にすれば、万事解決です（一旦PCR産物をクローニングしたのに、なぜわざわざ、逆にPCR産物にしてからシークエンスに使ったのか、そのココロがよく理解できない）。 今回の実験で、コロニーPCR産物のシークエンスの波形がきれいに出なかったことについては、 ・PCR産物の精製（プライマー除去）は、どの程度確実に行われているか？ ・サイクルシークエンス反応は、自分でやったか、それも外注か？　あるいはシークエンスプライマーの出所はどこか？（業者が自前のものを使ったのか、依頼主が鋳型DNAとともに供出したものか） シークエンスプライマーは、単にPCRするときのプライマーより高精度でなければなりません。たとえば、合成エラーや分解などがひどくて、長さがまちまちなプライマーが混入しているとすれたバンドが重なり合って読めなくなります。

(無題) 削除/引用 No.3679-9 - 2010/12/14 (火) 17:31:28 - TS 安価な業者は、読めなくても何も言ってこないで結果を送りつけることがありますが、問い合わせれば、原因を提案してくれるはずです。別料金でしょうが、少しは対応してくれると思いますよ。 それと、コロニーPCR産物をシークエンスしているのですか？ コロニーピックアップして、ミニプレップできないのですか？

(無題) 削除/引用 No.3679-8 - 2010/12/14 (火) 17:10:51 - Edy しかし、そもそもPCR産物のダイレクトseq.で「安定してきれいな波形データ」を得ようとするのが問題なのでは、、、 ある特定の（既知の）PCR産物で実験系が確立しているならまだしも、未知配列の場合はきれいな結果は期待しません。 お金を払って外注に出すのなら、私ならプラスミドを抽出精製してから送ります。

(無題) 削除/引用 No.3679-7 - 2010/12/14 (火) 17:09:17 - Edy コロニーPCRのプロダクトをどのようにシークエンシングの反応にもっていっているのでしょうか？ 1. 泳動で増幅チェックした残りの反応溶液をそのまま（比較的大量用いて） 2. 残りの反応溶液を希釈して（微量を用いて） 3. 泳動で増幅チェックしたゲルから切り出しやカラムなどにより精製して 手間がかかるのは3>2>1で、きれいなシークエンシング結果が得られるのはその逆でしょう。 例えば、PCR反応溶液をそのままseq.反応溶液の1/5ほど鋳型として用いようものなら、seq.用のプライマーだけでなくPCR反応からキャリーオーバーされたプライマーからもプライミングが起こり、当然結果はグチャグチャになります（Dye terminatorの場合）。キャリーオーバーされたdNTPやバッファー成分の影響もあるでしょう。 私たちは、手間・結果のきれいさの中間を取って、2の方法でやっています。 seq.反応溶液10μLあたり0.1-0.3μLのPCR溶液を鋳型として加えています。 （PCRの増幅がよければ0.1程度、悪ければ0.3程度） 実際には、8-20倍にdH2Oで希釈したPCR溶液 2μLに、0.32-1.0μM プライマー 5μLとDye terminator seq. mix (1:4希釈) 3μLを加えて反応しています。 （プライマーの濃度は、一旦結果を見てから調節しています）

(無題) 削除/引用 No.3679-3 - 2010/12/14 (火) 13:03:38 - ~ 外注先の担当者は何と言っているのですか？ 次も注文を受けるためには、読めませんだけでは終わらせないと思うのですが。 途中まで読めているのかそれとも始めからダメなのかや、forward, reverseの読めない組合せによっても、予想される問題点は変わってくると思います。 (半分というのがforward全部を意味していて、forwardと似ている配列が目的の配列中にあったりしませんよね) とりあえずは、読めなかったコロニーについてミニプレップをし、精製したプラスミドで同じように読んでみてはいかがでしょうか。 コロニーPCR部分の不具合が原因かどうかは判断できると思います。

(無題) 削除/引用 No.3679-2 - 2010/12/14 (火) 12:58:53 - 中年 PCR産物は、ゲルでははっきりと見えないようなマイナーな断片が含まれている可能性がありますし、量の見積もりにも落とし穴がいくつかあります。 ポジティブなコロニーからプラスミドをミニプレップして、それをシークエンスすれば解決します。

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