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(無題) 削除/引用 No.3678-15 - 2010/12/16 (木) 07:49:35 - de 上司、担当教官、まもしくは先輩にも聞いてみましょう。

(無題) 削除/引用 No.3678-14 - 2010/12/15 (水) 22:02:56 - Actias No.3678-11 に１票。 トピ主さんは「同条件」といっていますが、「以前に」ともいっているので、同じとは言い切れません。 やり直しの結果（サンプルを二分して別解析をした）を待ちたいです。

(無題) 削除/引用 No.3678-13 - 2010/12/15 (水) 03:11:46 - おお >[Re:6] ~さんは書きました : > 無・弱・強 > 1時間 10・70・20 (%) > 4時間 20・40・40 (%) > という場合（数値は適当）、 > 強だけ見ている共焦点では40%の4時間後がピーク、弱も見ているFACSだと90%の1時間後がピークになりますよね。 > だらだらしている蛍光強度を高い方から積分していったら、4時間後の方が数字が多い場合が出てきませんか？ きょう焦点で50%なら、FACSで50%のところでいきちを設定して、そのいきちでもう一方 の効率がきょう焦点とFACSでいっちするか見るのもてかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.3678-12 - 2010/12/15 (水) 02:26:31 - おお >[Re:10] みさんは書きました : > 真っ先に思ったのは： > 特にFACSで観察したシグナルは細胞内に入った蛍光と、細胞表面に付着した蛍光とを区別できているのでしょうか？ そうですよね。私もそう思ったんですが、最低限洗った同じ条件で観察しているかをその点をクリアーする前に聞きたかったんです。標識オリゴって表面についていて中に入ってないのは比較的均一にそまって、入っているのはドット状というかアグリゲーションしているように見えるらしいですね。 1時間という時間で評価するのが妥当かどうかもちょっと検討した方がいいかもしれませんが、実験自体がよく分かりませんので、、、

いちばん気になるのは 削除/引用 No.3678-11 - 2010/12/14 (火) 23:07:13 - ami > しかし、以前に同条件で共焦点顕微鏡で観察したところ、 同じ実験の中で、両方を比較しているのではないのですよね。同じ実験で、並行して２つの方法で比較してはどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3678-10 - 2010/12/14 (火) 22:33:01 - み 真っ先に思ったのは： 特にFACSで観察したシグナルは細胞内に入った蛍光と、細胞表面に付着した蛍光とを区別できているのでしょうか？

ありがとうございました。 削除/引用 No.3678-9 - 2010/12/14 (火) 16:46:40 - 実験初心者 解析をもう一度やり直してみたいと思います。 色々とご教授いただきありがとうございましたm(U_U)m

(無題) 削除/引用 No.3678-8 - 2010/12/14 (火) 16:41:19 - ~ >不勉強なので教えていただきたいのですが、細胞からの排出が促進される要因としてはどのようなことがありますか？ >リポソームのサイズなどによるものでしょうか？ 不勉強なので全く分かりません。 FACSで4時間後でpositiveの細胞が減る理由を適当につけただけです。 排出か分解か、細胞増殖等による希釈位だと思います。

(無題) 削除/引用 No.3678-7 - 2010/12/14 (火) 16:17:11 - 実験初心者 ~さん お返事ありがとうございます。 確かにFACSと顕微鏡の感度の差を考えると、閾値の取り方のせいなのかもしれないです。 データの再解析をおこなってみようと思います。 >無が時間経過で減る理由は分かりませんが、細胞によっては検出限界以下になるまで排出したのかもしれません。 不勉強なので教えていただきたいのですが、細胞からの排出が促進される要因としてはどのようなことがありますか？ リポソームのサイズなどによるものでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3678-6 - 2010/12/14 (火) 16:00:33 - ~ 閾値の問題だと思いますけどね。 >きれいなシングルピークにはならず、だらだらっと分布している感じです。 ということは、細胞ごとに蛍光強度は異なりますよね。 FACSで見れる細胞全てを共焦点でもきちんと見えると確認してはいませんよね。 FACSで見れて共焦点では見えない蛍光強度を弱、両方見れる強度を強として、 無・弱・強 1時間 10・70・20 (%) 4時間 20・40・40 (%) という場合（数値は適当）、 強だけ見ている共焦点では40%の4時間後がピーク、弱も見ているFACSだと90%の1時間後がピークになりますよね。 だらだらしている蛍光強度を高い方から積分していったら、4時間後の方が数字が多い場合が出てきませんか？ 無が時間経過で減る理由は分かりませんが、細胞によっては検出限界以下になるまで排出したのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3678-5 - 2010/12/14 (火) 15:39:19 - 実験初心者 おおさん お返事ありがとうございます。 >閾値の取り方で解釈が変わる可能性がないかということでこの質問をした次第です。たとえば1時間と4時間でくらべて、一時間のほうか弱いところにピークがあるとするとそのピークをきるかどうかで結果がちがってきますよね。 ピークの位置は時間により変化はありません。 なので、閾値の取り方には問題ないと思うのですが…。 顕微鏡観察時はトランスフェクション培地よりPBSに交換して観察しました。

(無題) 削除/引用 No.3678-4 - 2010/12/14 (火) 15:15:02 - おお >[Re:3] 実験初心者さんは書きました : > ただ、きれいなシングルピークにはならず、だらだらっと分布している感じです。 閾値の取り方で解釈が変わる可能性がないかということでこの質問をした次第です。たとえば1時間と4時間でくらべて、一時間のほうか弱いところにピークがあるとするとそのピークをきるかどうかで結果がちがってきますよね。 > 顕微鏡観察時は固定はせず、生細胞を観察しています。 > トランスふぇくしょんした培地でそのまま見ているかというのが知りたかったところなのですが、もしかしたら固定しているかもとおもったりしたもんでこんな質問になってしまいました。洗ってから見るのとトランスフェクションした培地で見るのは違ってくるかもというのが最初に思ったことです。

(無題) 削除/引用 No.3678-3 - 2010/12/14 (火) 14:15:03 - 実験初心者 蛍光分布ですが、未処理の細胞と比較してピークが異なってはいます(蛍光強度が高いほうへ移動しています)。 ただ、きれいなシングルピークにはならず、だらだらっと分布している感じです。 顕微鏡観察時は固定はせず、生細胞を観察しています。

(無題) 削除/引用 No.3678-2 - 2010/12/14 (火) 12:33:39 - おお FACSデータの蛍光強度の分布はどうですか? １時間後とかに顕微鏡で見る時固定してますよね、、、

FACSデータの細胞個数と共焦点顕微鏡の画像 削除/引用 No.3678-1 - 2010/12/14 (火) 12:26:41 - 実験初心者 初めまして。 よくわからない結果が出たので、アドバイスお願いいたします。 リポソームを用いて、FITC標識オリゴを細胞(HEK293)に導入する実験をおこなっています。 トランスフェクションより1時間後、4時間後の細胞数をFACSで解析しました。 未トランスフェクションの細胞群と比較し、FITC蛍光がみられると判断した領域内の細胞数で比較をおこなったのですが、1時間の方がFITC蛍光の観測される細胞数が多いことがわかりました。 しかし、以前に同条件で共焦点顕微鏡で観察したところ、明らかに導入より4時間後の方が蛍光は多く観測されました(目視)。 わかりにくい文章で申し訳ありません。 この違いはどこに起因するものでしょうか？ 何か気づいたことがあれば教えてください。

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