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(無題) 削除/引用 No.3674-13 - 2010/12/14 (火) 10:02:19 - 山元 皆様ご回答ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3674-12 - 2010/12/13 (月) 22:22:20 - おお 感覚では容量で10%も加えればかなり押さえられると思います。 99%活性が押さえられても1%の影響が無視できないようなものではさらに過剰に入れる必要があるかもしれません。 血清のトリプシンインヒビターの量やユニット数を調べているものを調べれば大体の理論値はでるとおもう。

そういえば 削除/引用 No.3674-11 - 2010/12/13 (月) 18:03:53 - ~ 細胞をPBSで洗わないでトリプシンをかけると、全然効きませんよね。 2~5mLのトリプシンをかけていて、培地が約0.5mL残っていると仮定すると、 下記の数値はそれほどずれていないかと。

(無題) 削除/引用 No.3674-10 - 2010/12/13 (月) 17:28:54 - ~ >この方法でTrypsinを不活性化させるために、どの程度の量の培地を加えればいいのかを疑問に思っただけです。 >Trypsinに対してどの程度の培地を加えれば良いのでしょうか？ トリプシンの不活性化だけの話でいいのですよね。 0.25%のトリプシンを使っているときも1 vol.の培地を加えていたので、 0.05%のトリプシンであれば0.2 vol.でも足りると思います。 ただ、EDTA濃度に対するカルシウム、マグネシウムイオンの添加濃度が数十%しかないので、細胞株によってはキレート作用による細胞の剥離は止まらないでしょう。 EDTAの影響も含めた質問であれば、細胞株に依存するでしょうから、実地でやるしかないでしょう。

(無題) 削除/引用 No.3674-8 - 2010/12/13 (月) 17:03:37 - 山元 質問自体は、この方法でTrypsinを不活性化させるために、どの程度の量の培地を加えればいいのかを疑問に思っただけです。 結局のところ、Trypsinに対してどの程度の培地を加えれば良いのでしょうか？ 書き方が紛らわしく、すみません。

(無題) 削除/引用 No.3674-7 - 2010/12/13 (月) 16:56:34 - おお もしかして、血清が実験で邪魔をすることを考えているのでしょうか? それならトリプシンインヒビター(soy bean由来がよくつかわれるとおもう)を使うという てもあると思う。

(無題) 削除/引用 No.3674-6 - 2010/12/13 (月) 16:50:47 - おお 血清にはトリプシンインヒビター(タンパク性のもの)が大量にふくまれてます。なので大抵の細胞はトリプシンを除かずバイチにと混ぜでフラスコやシャーレにまいても問題がないことがおおいです。 ただそれでも１度PBSなどで洗って除くことを推奨するひとはいます。非常にあつがいが難しいとか、センシティブな細胞は洗った方がいいこともあるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3674-5 - 2010/12/13 (月) 15:50:37 - う-ん >阻害機構も分かればお願いします。こちらに関しましても培地中金属イオンや血清中タンパク質など、サイトにより書かれていることが異なります。 トリプシンに対して、アンチトリプシンが働くためではないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3674-4 - 2010/12/13 (月) 14:53:31 - ~ >Trypsinを添加すると直ちに剥がれるものもあるため、中和する手段を取っています。 このタイプであれば、微妙に中和したトリプシンを使うよりも、PBS等で薄めたトリプシンを使うほうがコントロールが楽かと思います。 ヒト繊維芽細胞をはがす際には0.05% Trypsin, 0.02% EDTAをPBSで2.5倍くらいに薄めて使用していました。 原液をかけると、細胞−細胞間の結合よりも細胞−ディッシュ間の結合が早く切れるようで、シート状の細胞がめくれ上がってダマになってしまいました。 また、お使いの細胞で、トリプシンとEDTAのどちらが剥がれるのに影響しているのかは確認していますか？ 繊維芽細胞を剥がした後で遠心しないで継代すると調子が悪くなるのは、EDTAの影響の方が大きいようです。 トリプシンの影響が大きいと判断できるだけのデータを取っているのでしたら、後はトリプシンの濃度も検討すればいいだけではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3674-3 - 2010/12/13 (月) 14:37:17 - 山元 >>Boston-Pullman さん ご返信ありがとうございます。 その方法も存じておりますが、私が現在使っている細胞は付着力が乏しい細胞であり、Trypsinを添加すると直ちに剥がれるものもあるため、中和する手段を取っています。

(無題) 削除/引用 No.3674-2 - 2010/12/13 (月) 13:11:54 - Boston-Pullman 私はいつも余分なトリプシンを吸い取って、３分インキュベーションします。その後、５mLの培地に懸濁して、撒きなおします。遠心も必要ないですし、トリプシンの中和とか考える必要もありません。

細胞培養 継代時の培地によるTrypsinの中和について 削除/引用 No.3674-1 - 2010/12/13 (月) 12:38:45 - 山元 細胞の継代を行う際、トリプシン処理後に、血清培地にて中和処理を行いますが、実際のところトリプシンに対してどの程度の培地を加えれば中和できるのでしょうか？ 現在使っているトリプシンは0.05%Trypsin-EDTA、培地はDMEM（10%FBS、1%P/S添加）を使用しています。 自分で調べてみたところ、等量、2倍量、1/2量、適当など様々で、実際の最低量を知りたいです。 あと、阻害機構も分かればお願いします。こちらに関しましても培地中金属イオンや血清中タンパク質など、サイトにより書かれていることが異なります。

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