全12件 ( 1 〜 12 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.3666-12 - 2010/12/13 (月) 02:15:33 - ABZO 膵臓なら、トリプシンインヒビター含んだbufferか、それかSDSsample buffer中で直接ホモジナイズしたらいいかも。

(無題) 削除/引用 No.3666-11 - 2010/12/12 (日) 15:03:23 - ats 膵臓はproteaseが非常に強いので、ihibitorを入れておいてもホモジェナイズした時点で分解が進むと聞いたことがあります。液体窒素等での急速凍結・粉砕・TCA沈殿を使った方がよいのでは。

(無題) 削除/引用 No.3666-10 - 2010/12/12 (日) 01:24:18 - ABZO この、上清に等量のグリセロールを加える理由は何よ。

(無題) 削除/引用 No.3666-9 - 2010/12/11 (土) 19:25:11 - z ＞　遠心後、上清をとり、等量のグリセロールを加え、タンパク溶液を作ります。 ＞ ＞　そのタンパク溶液を定量し、濃度を求めた後、 このあたりが危ないように思います。 １）グリセロールが多すぎてタンパク定量がうまく行っていないか、 ２）あまりに高濃度のグリセロールでSDS化がうまく行っていない可能性はどうでしょうか。 あなたのタンパク定量では、50%グリセロールが入っているタンパクをうまく定量できますか？スタンダードにグリセロールを入れてみればすぐに判ります。 培養細胞試料の20ugと肝臓試料20ugをSDS-PAGEしてCBB染色すると、およそ同じ程度の染色像を確認で切るのでしょうか？　ウェスタン後の膜をもう使わないのなら、CBB染色しても良いかもしれません。同程度のCBB染色が認められるのなら、SDS化に問題があるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3666-8 - 2010/12/11 (土) 14:11:47 - rum >TS様 ABZO様の文章にでてきていた｢スメア｣が私の言いたかった状態です。 電気泳動における単語の学習不足ですみません。

(無題) 削除/引用 No.3666-7 - 2010/12/11 (土) 14:10:21 - rum >ABZO様 回答ありがとうございます。 一応今回用いた1次抗体はanti-rabbitのものでした。 ABZOさんのおっしゃる通り、今回アプライ量が多すぎたのかもしれません。 後日アプライ量を少し調節してもう一度ウエスタンし直したいと思います。

(無題) 削除/引用 No.3666-6 - 2010/12/11 (土) 14:02:48 - rum >TS様 2×SDSは、BPBとメルカプトエタノールの量が少しだけ違いますが、 Laemmli Sample Bufferとほぼ同じものです。 メンブレン全体がそまってるのではないです。 組織から得たサンプルを流したレーンで エキストラバンドが連なって、薄く全体的にバンドがみえている状態です。

すみません間違えました 削除/引用 No.3666-5 - 2010/12/11 (土) 13:51:47 - rum >pon様 書き間違えていました。ごめんなさい。 ご指摘ありがとうございます。 たんぱく質分解酵素ではなく、たんぱく質分解酵素阻害剤を入れています。

１次抗体の種は何よ。 削除/引用 No.3666-4 - 2010/12/11 (土) 01:47:45 - ABZO もし関係ないならごめんなさいね。マウス組織ということで思ったんだけど、１次抗体がウサギ由来抗体なら問題ないけど、ラット由来抗体やマウス由来抗体だと、２次抗体は抗ラットIgG　や抗マウスIgGという事になるわけで、これらは組織の内在性のマウスIgGとそれなりに反応してしまうと思うんだが。組織だからPBSできれいに洗ってもやっぱ血だのなんだのがそれなりに混じってるからね。理論的には50Kと２５k辺にきれいに２本出ると思いたいところだが、実際はいろいろなところに変なバンドが出る。特にアプライ量が多いと全体にスメアっぽく汚くなる。

(無題) 削除/引用 No.3666-3 - 2010/12/10 (金) 20:26:17 - TS Laemmli Sample Bufferは使われているのですか？ 2X SDSというものにb-MEも入っているのですか。 もやがかかったように、の感じがよくわからないのですが。 メンブレン全体が？　バンドが？

(無題) 削除/引用 No.3666-2 - 2010/12/10 (金) 18:14:17 - pon ＞タンパク分解酵素を含むbufferを加え、 とは，タンパク分解酵素「阻害剤」ではなくですか？

マウスの組織から得たサンプルのウエスタンブロッティング 削除/引用 No.3666-1 - 2010/12/10 (金) 16:42:43 - rum 実験初心者なので、初歩的な質問かもしれないのですが、 是非回答お願いします。 マウスを解剖し、膵臓、腎臓の一部を切り取り、 タンパク分解酵素を含むbufferを加え、 ホモジナイズし、遠心します。 遠心後、上清をとり、等量のグリセロールを加え、タンパク溶液を作ります。 そのタンパク溶液を定量し、濃度を求めた後、 2×SDSでウエスタンブロッティング用のサンプルを作り、 1レーンにつき、20μgあたりのタンパクを流したのですが 全体的にもやがかかったようにエキストラバンドだらけになりました。 ポジコンとして、培養した細胞から得たサンプルも20μg流したのですが、 そのサンプルについてはきれいに目的とする部位だけにバンドが検出されたので、抗体濃度(1次抗体：1000倍、2次抗体：20000倍)にさほど問題はなかったと思っていますが、 細胞と組織からのサンプルでは抗体の至適濃度が異なるのでしょうか。 また、組織から得たサンプルにおいて、1レーンにつき20μgのタンパクを流すのは多すぎるのでしょうか。

全12件 ( 1 〜 12 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---