InvitrogenのKitを用いて、ウェスタンを行わず、SDS-PAGEから直接Hisタグ融合タンパクのバンドを確認する実験を行っています。
【手順】
@：電気泳動
A：エタorメタ＋酢酸bufferにて固定
B：超純水にて洗浄×2
C：Kit在中のHisタグ蛍光検出bufferにて反応開始
D：リン酸bufferにて洗浄×2
E：CCDカメラにてバンドを確認
なのですが、バンドが確認できませんでした…。
【プロトコール】によれば、
@：UVライトボックスにゲルを置くだけでは可視不可である。
A：UVランプ付のCCDカメラを用いること。
B：ただし、UVランプが無くてもレーザーベースのCCDスキャナ560nm〜610nmのものも用いることができる。
C：あと、場合によればUVライトボックス（310nm〜）に長時間ゲルを露出うする必要がある。
が、確認方法のようです。
↑この記載を理解したうえで、自室のCCDカメラについて電話で問いただしたところ、『カメラの励起光は470nmなので、560nm〜の蛍光検出は不可能にちかい』とのことでした。少なくともプロトコルのBが自室ではムリということは解かりましたが、@とCは何となく矛盾しているのでは？と思えて止みません。
宜しければ、似た経験から得たコトやご意見があればお聞かせ下さい。
今後は、プロトコルのCを実践しようと考えています。 |
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