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(無題) 削除/引用 No.3657-15 - 2010/12/12 (日) 17:01:00 - おお 培地をかんりゅうするような方法を書きましたが、意外と大がかりでなくてもできそうな気がしてきました。要するに透析膜を隔てて両側に培地があればいいわけですから。 またはマイクロキャリアー上で細胞をかい、透析まくのなかにほりこんじゃえば普通の透析しているような感じで培養できます。高密度培養にしゅうくうしの膜の管をつかうことがあります。そう言うのは蛋白も通るような膜をつかったりするようですが、目の細かいのを探せばあるかもしれません。 一週間ほど培養しているようですが、一週間培地を変えずというのは無理なような気がします。pHが７にさしかかる前に培地を交換して、ディッシュからとった培地は保存しておいて、精製時に交換しで回収した培地と混ぜて使うとかした方がいいかもしれません。 COSなどのトランジェントは96時間後までにピークをすでに迎えてしまっています。4日間も培養すれば十分な蛋白が取れるのではないかと思いますが、そんなに長期にこだわるのは理由があるのかなあという気がしています。実際はどうなんでしょうか? atsさん HEPESは使ったけどだめだったっていってたようなきがします。。。

(無題) 削除/引用 No.3657-14 - 2010/12/12 (日) 14:57:24 - ats ~さんも言われているように不明な点が多いですが、 (1)目的タンパクは分泌タンパクである。(2)血清無添加DMEM培地でなく、市販の無血清培養用の培地を使用している。 以上の前提で、pH7以下に下がらない条件で、「手軽に」出来るだけ多くの目的タンパクを調製したいというのが目的でしょうか？ HEPESは試してはいないのですよね。10-25mMほどなら大抵の培養細胞に無害です。タンパクを作らなくなったのは別の理由だと思います。自作する場合はEndotoxin・残留不純物(洗剤など）の混入に気をつけてください。使用するメスシリンダー等も通常？の洗い方のみではダメです。 精製法にもよりますが多少の血清は問題無いなら、AdavnceDMEM+10~20mM HEPES+0.5~2% FBS+0.5% Yeast Extract (or 0.3% Yeastlate)のような培地を使うと、DMEM+10%FBS培地よりCOS/CHO/HEK293細胞では「とある分泌タンパク」の収量は上がった経験があります。個人的にはDMEM/F12が細胞を選ばないので好き？です。Yeast Extractは50%(w/v)水溶液(filter滅菌）を作製すると便利です。一過性発現なら70-80%コンフルエントで遺伝子導入して1~2日置きに培地を交換（＝回収）すれば6日ほど細胞は持ちます。〜100ｍLスケールでは安価でお手軽です。

いまだに条件や目的がよく分かりません 削除/引用 No.3657-13 - 2010/12/12 (日) 13:17:22 - ~ もしかして、書かれている無血清培地というのは、無血清の条件のままで長期間細胞培養が出来るように設計されている市販培地のことではなく、単にDMEMの血清抜きなのでしょうか？ そうであれば、その条件で数日細胞が生きているだけで喜ぶべき状態で、pHのコントロールには大きな労力が必要になると思います。 >今考えているのは、まずはCOS-1細胞での一過性発現にて目的のタンパク質がとれるか検討した後にstable cell lineの作製を行いたいと考えています。 実際の目的・条件にはpHを7.0以上に維持するというのは無いんですか？ そうであれば、細胞が死なない限りはpHの低下を受けれてもいいのでは。 pHの話が絶対的な条件なのか、単に下がったのが気になっているだけなのかで、かける労力が変わってくると思いますが。 >�A)DG44(stable)…トランスフェクション後7日間培養することでタンパク発 これをstableと呼ぶのかは疑問ですが、少なくとも最大7日まで培養できればいいのですよね。 毎日(または1日2回)培地交換すればそれなりにpHの低下は抑制できます。 おおさんの書かれているのは、かん流培養のことかと思いますが、それの簡易版です。 >リン酸を多く消費することを聞いたことがあったのですが、あまり深く考える必要はないのでしょうか。 リン酸濃度を測定してコントロールしたいというのであれば、やってみると面白いと思います。 ただ、その労力は他に向けた方が今の目的には近づくと思います。 私は培養上清できちんとリン酸濃度の変化を見れたことがありません。 （あまりちゃんとやっていませんでしたが）

(無題) 削除/引用 No.3657-12 - 2010/12/12 (日) 04:16:03 - おお >細胞によって増殖の速いものでは、リン酸を多く消費することを聞いたことがあったのですが、あまり深く考える必要はないのでしょうか。 リン酸を消費してくれるなら、アルカリに偏ってくれそうな気がしました。。。実際はそのほかの溶液に含まれているもの次第でしょうけど。

(無題) 削除/引用 No.3657-11 - 2010/12/11 (土) 00:45:25 - ab トランスフェクション時の細胞密度が高いのが原因ということでしょうか。 どのようなプロモーターを用いているかわかりませんが、CMVなどを用いた一過性の発現なら2~3日で発現のピークがあり、またSV40の複製開始点を含むプラスミドであれば、COS-1細胞内でプラスミドが複製されるので、トランスフェクション後2日でも検出は十分可能だと思います。 stableの発現株については、トランスフェクション後に一度大きいディッシュに継代したほうが、薬剤の効きもよいのでセレクションもしやすいし、培地のpH変化も抑えられます。 場合によっては、一過性の発現でも継代すれば細胞密度を減らすころができるので、pHの変化を抑えられるはずです。 大量培養については、予算に余裕があればバイオリアクターを使ってpHを安定させることが最良です。 ひとつ疑問は、それほどpHの変化に影響を受けるタンパク質かどうかです。 実際にpH安定性を確認されたのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3657-10 - 2010/12/10 (金) 22:35:23 - naonao >>おお様 >>ちょっと大がかりなことがゆるせるのであれば、培地を循環させ、透析して戻すようなシステムがあればいいかもしれません。どの程度の労力でできるかは検討つきません。 確かに手間のかかる検討ですが、面白い方法ですね。 >>リン酸はたいしゃされるといっても、mM単位で入れればそんなに消費するもんなんでしょうか、、、そもそも細胞が利用していて、リン酸か蛋白を消化したらリン酸は放出されるでしょうし、なくなるということはあまり考えなくてもいいと思うのですが、、、あとはリソソームの活動をいくらかでも押さえてやればチョットはましになるかもしれませんが、、どの程度といわれると、、、 細胞によって増殖の速いものでは、リン酸を多く消費することを聞いたことがあったのですが、あまり深く考える必要はないのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3657-9 - 2010/12/10 (金) 22:30:26 - naonao >>~様 大変参考になる沢山のご意見ありがとうございます。 >>High Glucose (4.5 g/L), low glucose (1 g/L)のどちらかなのでしょうか？ 細胞を増殖させるために使用している培地はHigh glucoseのD-MEMです。 また、トランスフェクション後、無血清培地に培地交換してタンパク質を発現させています。これは、精製する際に余計なタンパク質をなるべく少なくするためです。 >>無血清培地よりも緩衝能が高いことが期待されます。 ただ、それでもpHが0.2下がらない培地というのは難しいと思います。 >>それで細胞が死なないのであればいいのですが… 仰る通りです。細胞種や細胞株によっても異なることが考えられるのでやってみなければ分からないところですよね。 １．リコンビナントタンパク質を発現、精製する ２．タンパク質の性質上、トランスフェクション後の培養条件はpH7.0を下回らないことが必須 ３．培養条件の確立ではなく、目的タンパク質を必要量得る という目的ですね。 今考えているのは、まずはCOS-1細胞での一過性発現にて目的のタンパク質がとれるか検討した後にstable cell lineの作製を行いたいと考えています。 �@)COS-1…トランスフェクション後3~4日間培養することでタンパク発現 �A)DG44(stable)…トランスフェクション後7日間培養することでタンパク発現 >>�@pHを手動で維持する これは、確かに細胞次第では一番現実的で簡便な方法かもしれませんね。 >>�ApHが下がる前に培地交換 なるほど。そういう発想もあったんですね・・・。 ただ、個人的に思うのはその都度培地を交換するため大量消費してしまいコストがかかってしまう問題がありますね。

もう一度目的に立ち返って 削除/引用 No.3657-8 - 2010/12/10 (金) 14:54:46 - ~ 事情がよく分からないのですが、 １．リコンビナントタンパク質を発現、精製する ２．タンパク質の性質上、培養条件はpH7.0を下回らないことが必須 ３．培養条件の確立ではなく、目的タンパク質を必要量得る という目的であっていますか？ 違うのであれば、回答の方向性もずれてしまいます。 現在の比生産性を維持できたとしたら、どの位の量の培養（cells×day）が出来れば、目的のタンパク質が得られそうなのでしょうか。それが無茶な量でなければ、今の手持ちのもので力技で済ませたほうが楽かもしれません。 例えば、 �@pHを手動で維持する フェノールレッドを入れられるのであれば、色を見ながら毎日アルカリを入れていけば、とりあえずはpHの維持はそれなりにできます。 アルカリによってどんどん浸透圧が上がり、細胞の成育が悪くなるでしょうけれども、回収するまでそれなりに生かしておければ、目的量に到達するかもしれません。 �ApHが下がる前に培地交換 タンパク質の安定性や、その後の精製方法によりますが、 毎日（または培地ｐHが7.0以下になる前に）培地交換して、回収した培地をプールする。 回収後の培地は、細胞を無視して目的タンパク質にやさしい条件に調整できるでしょう。 アセトンなどで沈澱させておくのがいいのか、単に冷蔵庫や冷凍庫に入れておけばいいのかなどは、タンパク質によると思います。

(無題) 削除/引用 No.3657-7 - 2010/12/10 (金) 14:48:39 - おお ちょっと大がかりなことがゆるせるのであれば、培地を循環させ、透析して戻すようなシステムがあればいいかもしれません。どの程度の労力でできるかは検討つきません。 リン酸はたいしゃされるといっても、mM単位で入れればそんなに消費するもんなんでしょうか、、、そもそも細胞が利用していて、リン酸か蛋白を消化したらリン酸は放出されるでしょうし、なくなるということはあまり考えなくてもいいと思うのですが、、、 あとはリソソームの活動をいくらかでも押さえてやればチョットはましになるかもしれませんが、、どの程度といわれると、、、

(無題) 削除/引用 No.3657-6 - 2010/12/10 (金) 14:34:21 - ~ >酸性物質をあまり放出しない細胞株をクローニングすることは、試してみようと行ってたいと思います。 耐高浸透圧の性質を持った細胞株を取った話は聞いたことがありますので、 pHが下がらない(またはより高pHで増殖可能な)細胞株も取れないことは無いと思います。 >今現在D-MEMに10%のウシ血清を加えた状態で培養している状態です。 High Glucose (4.5 g/L), low glucose (1 g/L)のどちらかなのでしょうか？ 無血清培地と聞いていたのでもっと高濃度の培地を使っていると思っての書き込みでした。 これらの濃度は、私が考えていたグルコース濃度を減らした後の濃度です。 >他の低グルコースの培地を試すという解釈でよろしいのでしょうか。 これはいつでも改善が期待できる実験だと思います。 >血清に含まれる緩衝能を用いてタンパク質を発現させれば無血清培地よりもpHの変化は抑えられることは考えられますか。 はい。 無血清培地よりも緩衝能が高いことが期待されます。 ただ、それでもpHが0.2下がらない培地というのは難しいと思います。 >必ず使用する培地のpHを予めpH8~9付近に調製して細胞を培養し増殖したものを使用すること。 それで細胞が死なないのであればいいのですが… >(1)無血清培地ではないためアフィニティーなどの高い結合を有するtaqと担体の選択する必要がある これは培養できるようになり、一度精製してみてから考えても遅くは無いと思いますけど。 >pHにより糖代謝が変わる等も影響されるかとは思いますが 私もそう思いますが、実験の成立要件を満たすためには仕方ないですよね。

(無題) 削除/引用 No.3657-5 - 2010/12/10 (金) 13:53:47 - naonao >>おお様 貴重なご意見ありがとうございます。 リン酸は、少し頭に浮かんだのですが、COS-1におては同じ培地で早くて3日、DG44においては同じ培地で7日置くためリン酸を代謝してしまうことが考えられます。その都度加えていけば問題ないのでしょうか。 >>しかしpH6ぐらいって、そもそもph6.5ぐらいになるとかなりキツくないですか、普通の培養でも。通常酸性にすると支障があるのでしないと思うんですが。。。 仰るとおり酸性側に傾くとよろしくないことは分かっているのですが、タンパク質を発現させる際の無血清培地に70%コンフレントの状態でトランスフェクションしているため細胞の増殖に伴って酸性側に傾いてしまい結果、培地の色が赤色からオレンジ色になってしまいます。

(無題) 削除/引用 No.3657-4 - 2010/12/10 (金) 13:39:31 - naonao >>~様 様々な貴重なご意見ありがとうございました。 酸性物質をあまり放出しない細胞株をクローニングすることは、試してみようと行ってたいと思います。ただ、ファーメンターは残念ながら金銭的に難しいところがあります。 グルコース濃度を低くして培養することに関してですが、今現在D-MEMに10%のウシ血清を加えた状態で培養している状態です。この内容としては、他の低グルコースの培地を試すという解釈でよろしいのでしょうか。 少し安直ですが、血清に含まれる緩衝能を用いてタンパク質を発現させれば無血清培地よりもpHの変化は抑えられることは考えられますか。 その際には、必ず使用する培地のpHを予めpH8~9付近に調製して細胞を培養し増殖したものを使用すること。 ただし、(1)無血清培地ではないためアフィニティーなどの高い結合を有するtaqと担体の選択する必要がある(2)pHにより糖代謝が変わる等も影響されるかとは思いますが如何でしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3657-3 - 2010/12/10 (金) 13:35:47 - おお やはりインキュベーターのCO2濃度を下げるのが手っ取り早いですかねぇ。。。代謝を考えるてはあると思いますが、その辺はどうなるかわからないので、、、ピルビン酸入れたりもしますが、、、 緩衝能で考えるなら、リン酸とか使えるかなぁというのがよぎってますが、あとは塩基性アミノ酸の添加を増やすとか。。。 しかしpH6ぐらいって、そもそもph6.5ぐらいになるとかなりキツくないですか、普通の培養でも。通常酸性にすると支障があるのでしないと思うんですが。。。 あとマイコプラズマが感染していたら酸性に偏るのが早くなります。変だなとおもったら確認してみるのも必要かもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3657-2 - 2010/12/10 (金) 12:53:52 - ~ そもそも、pHをコントロールしていないのであれば、スタートが7.2くらいでも、7を下回るのは珍しくありませんよ。 培養条件の検討だけでなく、酸性物質をあまり放出しない（または塩基性物質をより取り込まない）細胞株を作るのも仕事の一つになると思います。 pHがより高い状態でも増殖・生産できる細胞株を作って、そこから培養を開始して、pHが下がっても7よりも上になるようにするという方法もありうるかもしれません。 それよりも、pHをコントロールできるファーメンターを用意して、貴方の望む条件でで培養したり、場合によってはその状態で飼いつづけて、その条件にアダプトした細胞株を取得するのが効率がいいかもしれません。 >�@タンパク質を発現させる際に培地のpH安定に保つ方法があるのか。 ファーメンターだと、NaOHやNa2CO3などのアルカリを入れて調整する方法はあります。 フラスコ培養でもやっているところがあるという話を聞いたことがあります。 細胞の代謝を調べ培地中の成分を変更することで、pHが安定に保たれたという話は聞いたことがあります。 例えば、グルコースの濃度を下げて、乳酸も代謝するようにすると、pHの低下を抑制できたそうです。 （その分グルコースをこまめに入れることになりますが） それは難しいというのであれば、違う種類の無血清培地も試してみてはいかがでしょうか。 培地によって、pHの下がり具合は変わります。 より単純に、炭酸水素ナトリウムの濃度を増やし、CO2濃度も上げることで緩衝能を高めるというやりかたもありますが、 何らかの酸性物質を放出して酸性に偏っているのであれば、限度があるかと思います。 http://www.sigmaaldrich.com/life-science/cell-culture/learning-center/media-expert.html >�A出来れば、pHを6〜7付近には研究上なるべくしたくないのですが中性付近からズレた際に起こる細胞への影響について pHにより糖代謝が変わるという発表は聞いたことがあります。

動物細胞用培地のpHを安定させる方法 削除/引用 No.3657-1 - 2010/12/10 (金) 01:41:36 - naonao 現在、COS-1やDG44等の細胞を用いてタンパク質を発現させる際に使用する無血清培地のpHが7.2〜7.4付近に調製を行っています。 しかし、経験したことがある方は分かるかと思いますが、CO2インキュベーター内に置いても培地のpHは酸性側に傾き安定しません。対策としてへぺス等も考えましたが、調べたところpHが傾くことはなくなったが細胞が増殖しない等の問題点が挙げられていました。 そこで、お聞きしたいのは下記の２つです。 �@タンパク質を発現させる際に培地のpH安定に保つ方法があるのか。 �A出来れば、pHを6〜7付近には研究上なるべくしたくないのですが中性付近からズレた際に起こる細胞への影響について（調べ方が悪いのか検索できなかったためご存じの方がいらっしゃいましたら教えて頂けると嬉しいです）。 皆様の実体験や知識等をよろしくお願いします。

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