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解決しました。 削除/引用 No.3638-8 - 2010/12/12 (日) 12:47:32 - 蜷森 PCRの条件検討を行ったところ、 プライマーの濃度、とくに鋳型となるオリゴの相補鎖側のプライマーの濃度をあげるとちゃんと７２baseのバンドが出てきました。あと鋳型とプライマーの比率だけではなくプライーの絶対濃度自体もかなり効いているようです。 どうやらＡＰさんのご指摘の通り、ことなるランダム配列を持ったもの同士がアニーリングして移動度が遅くなっていたようです。 皆様のご助力を心より感謝いたします。

(無題) 削除/引用 No.3638-7 - 2010/12/09 (木) 13:58:17 - AP この場合、尿素変性PAGEかフォルムアミド変性PAGEだと思います。 サンプルはフォルムアミドに溶解しなおして熱変性。 要は、シークエンスをスラブゲルでやるときと同様です。 DNAの変性電気泳動だと、アルカリアガロースもよく使われますが、アガロースでは短鎖の分離は厳しいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.3638-6 - 2010/12/09 (木) 01:06:17 - 蜷森 あと少し質問したいのですが、変性ゲルを作らなくても一本鎖にしたいサンプルだけホルムアルデヒドを入れて泳動してはだめでしょうか？ ＞＞＞＞ ホルムアルデヒドを加え２本鎖を９４℃で加熱した後急冷したサンプルを非変性ゲルで流しても大丈夫でしょうかという意味でした。すみません。

お返事ありがとうございます。 削除/引用 No.3638-5 - 2010/12/09 (木) 01:03:41 - 蜷森 ランダム配列があるとPCRの条件によっては最終的に2本鎖を形成してる分子 が少ないかもしれません。 変性ゲルで泳動してますか？ >>>>> ４−５%のポリアクリルアミドでしか試しておりません。 やったことはないですが変性ゲルというとホルムアルデヒド変性ゲルのことですね。 試してみます。 あと少し質問したいのですが、変性ゲルを作らなくても一本鎖にしたいサンプルだけホルムアルデヒドを入れて泳動してはだめでしょうか？ 72bpのバンドと90bpの2本のバンドがあったり、スメアやラダーになっているわけではないのですよね。 　ランダム配列の話ではありませんが、ベントDNAでは移動度が小さくなりますよね。 固定の配列部分にそのような高次構造に影響を与える配列がありませんか？ ＞＞＞　 ではないです。少しスメアになっていると言えばなっていますが、90base付近に一本のバンドが見えます。 　配列については部分的に相補鎖をくむかどうかプライマー発注前に一応調べたので多分問題ないと思います。あと２０baseのランダム部分が、ランダムになっていない他は全く同じprobeを作成したところ７２base付近にちゃんとバンドが見られました。 ランダム化された配列の部分が異なるPCR産物同士がアニールしてしまって、heteroduplexになっているのではないでしょうか。部分的にミスマッチがある二重鎖の移動度は小さくなるはずですから >>>>> 　最初にPCRをしたときにシングルバンドがちゃんと出たからいいやとおもって条件検討を全然していませんでした・・・・ 　鋳型とプライマーのモル比が大体　1:2000 ぐらi PCRサイクル２５回でやっています。 　PCRのプライマーの濃度を上げるかサイクル数を減らしてもう一度PCRをかけてみます。 返信が遅れて申し訳ありません。 初めて投稿したのですがこんなに早くアドバイスしていただけるとは・・・ ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.3638-4 - 2010/12/08 (水) 17:28:33 - AP その手の方法だと、増幅された配列は複数種であっておかしくないはずですね。 ひょっとすると、PCRサイクルが多すぎて、最後の方は鋳型とプライマーがアニールするより、ランダム化された配列の部分が異なるPCR産物同士がアニールしてしまって、heteroduplexになっているのではないでしょうか。部分的にミスマッチがある二重鎖の移動度は小さくなるはずですから。 クローニングしてしまえばミスマッチ修復系で、どちらかの配列に収斂してしまうと思いますが。

(無題) 削除/引用 No.3638-3 - 2010/12/08 (水) 09:28:45 - ~ 72bpのバンドと90bpの2本のバンドがあったり、スメアやラダーになっているわけではないのですよね。 ランダム配列部分が原因と考えるのは無理があるように思いますが。 ランダム配列の話ではありませんが、ベントDNAでは移動度が小さくなりますよね。 固定の配列部分にそのような高次構造に影響を与える配列がありませんか？ （どうやって調べればいいのか分かりませんが）

(無題) 削除/引用 No.3638-2 - 2010/12/08 (水) 08:48:54 - ンンノ ランダム配列なので特定の高次構造をとることは考えにくいですね。 ゲルシフトアッセイをやっていた時に、ボイルして変成させたDNAがアップ シフトしたことがあります。 ゲルの組成によっては1本鎖の移動度が小さいことがあるようです。 ランダム配列があるとPCRの条件によっては最終的に2本鎖を形成してる分子 が少ないかもしれません。 変性ゲルで泳動してますか？

ランダムオリゴの移動度について 削除/引用 No.3638-1 - 2010/12/07 (火) 22:42:56 - 蜷森 　ＳＥＬＥＸ法で使用するprobeを作成するため、２０baseのランダム配列を含有する72baseのオリゴを発注しました。 　その72baseのオリゴを鋳型として、両端に完全マッチする20baseのプライマーを用いてPCRで増幅を行いました。 　その後、ＰＣＲの増幅を確認するためにプローブを電気泳動で流したところ72baseではなく、９０base付近にオリゴが確認されました。 　 　そのプローブをクローニングしてシーケンスを読んでみたところ配列は72baseで、ランダム配列以外は、設計した配列と相違ありません。 　 　そこで、質問なのですが、ランダム配列が含まれるDNAの移動度が下がるという報告を皆さん聞いたことがないでしょうか？ 　 　よろしくお願いします。

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