ご意見ありがとうございます。
MEF細胞は妊娠14週齢のBALB/Cマウスから取得したものです。
ES細胞や山中博士の樹立したiPS細胞のフィーダー細胞として使用していたものです。
4因子はそれぞれマウスの臓器からRT-PCR法を用いて取得した配列を、pQMSCVというバックボーンベクターに乗せたものです。配列はGENEBANKおよびaddgeneの山中博士らのベクター配列と同じことを確認しております。
4因子を導入するとc-Mycが効いているのか明らかな増殖スピードの増加がみられるようになります、またレポーター遺伝子としてEGFPを発現するコンストラクトになっており、蛍光顕微鏡によって蛍光も観察できます。(ただし4因子なので1細胞に全てのファクターが入っているかはわかりませんが)
Titer測定において、全てのウィルスベクターが正常に感染出来ることを確認し、MOIも1以上を保ってインフェクションしております(MEFはあまりMOIが高いと死んでしまうのですが)
インフェクションした細胞のRT-PCR解析によって、4因子全てのmRNAの発現は確認しております(タンパクレベルでは抗体を購入してもらえないので確認できていません)。
4因子を導入するとコロニーらしきものは出来てくるのですが、ある一定期間を過ぎるとコロニー増殖は止まります。そのコロニーを新しいフィーダー細胞の上にpassしても増殖はしません。(いわいるリプログラムされていない中間体なのでしょうか?)
お手数をお掛けいたしますが、現在iPS細胞の樹立を行っていらっしゃる方がいらっしゃいましたらアドバイスをよろしくお願いいたします。 |
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