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(無題) 削除/引用 No.3611-9 - 2010/12/03 (金) 18:29:46 - A 蛋白質発現時の培地にZnを加えていますか？ あるZn要求性蛋白質を大腸菌で発現させる際に 培地にZnを加えないとちゃんとした構造を取る 事ができずに全て封入体に行ってしまう例を 見たことがあります。もし加えていないので あればこの場合も培地にZnを加えることで 改善するかもしれません。

補足説明 削除/引用 No.3611-8 - 2010/12/03 (金) 09:03:22 - kadekat 多数の回答ありがとうございます。 精製後には、イミダゾルを抜くために 透析を行っています。このときに透析外液に Znを加えています。 この透析で、カラム中で置換されたNiも 除去できると考えています。 活性というのは「比活性」のことです。 最初の質問での説明が不十分ですいません。 ンンノさんが言われるように、正しいフォール ディングの酵素が少ないことが比活性が低い 原因かもしれません。 とすると、Hisタグが酵素活性に影響する可能性は 低いと考えていいのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3611-7 - 2010/12/03 (金) 08:23:22 - ご参考までに 以前、Mn要求性のHisタグ付酵素をNiカラムで精製した時に、イミダゾルで可逆性の酵素活性の失活が認められました。透析してイミダゾールを除くと酵素活性は戻ります。 ご参考までに。

(無題) 削除/引用 No.3611-6 - 2010/12/03 (金) 01:21:06 - ンンノ 「活性」って比活性のことかな。 タグのアフィニティーだけで濃縮したら、アクティブじゃないフォールディングの 分子が混ざってるから、比活性が低くても当然じゃないですか。

(無題) 削除/引用 No.3611-5 - 2010/12/02 (木) 21:31:30 - とおりすがい こういう場合って、NiじゃなくてZnキレートカラムにするとどうなるんですかね。Niほどきれいにならないかもしれませんが。

(無題) 削除/引用 No.3611-4 - 2010/12/02 (木) 19:38:46 - kadekat HisTrap-HPカラムで精製しています。 溶出は、250mM イミダゾルを使用しています。 抽出から精製まで、全てのバッファーに Zn（0.1mM）を 入れると、収率が落ちることはありませんが、活性は 市販品の10％程度にしかなりません。 精製後にZnを入れ、4℃で１晩〜１週間ほど置くと 活性が徐々に上がってきます。 1週間の時点で市販品の半分程度です。

(無題) 削除/引用 No.3611-3 - 2010/12/02 (木) 16:42:12 - ats NTAカラム上のNiと酵素中のZnが置換すると聞いたことがあります。 全てのbufferに10uMほどのZnCl2を加えてみては、いかがでしょうか。 タンパクがカラムに結合しなくなるかな？

(無題) 削除/引用 No.3611-2 - 2010/12/02 (木) 16:32:58 - ザンギ アフィニティカラムから溶出するときにEDTAとか使ってませんか。

Hisタグは金属酵素の活性を低下させますか？ 削除/引用 No.3611-1 - 2010/12/02 (木) 15:57:34 - kadekat Znを要求する金属酵素を、Hisタグ付きの組換えタンパク質として 発現させたのですが、精製して活性を測ると市販品の 半分程度しか活性がありません。 色々調べて、HisタグはZnとも反応することが判りました。 そこで質問なのですが、酵素の活性中心に配位したZnに対して、 この酵素に付加したHisタグが反応して、正常な立体構造が崩れ て活性が低下するといったことは起こるのでしょうか？ 逆に、金属酵素にHisタグを付加しても活性に影響はなかった等の 経験談などがあれば、よろしくお願いします。

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