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有難うございました。 削除/引用 No.3609-15 - 2010/12/07 (火) 13:47:59 - hono APさん どうもありがとうございます。 だいぶ基礎知識が足りていないようで、申し訳ないです。 勉強になりました。 先日、ちょうど良い酵素でカットしたところ抽出後のプラスミドとも、確認用に使った酵素とも変わらない所にバンドが見られ結局きちんと切断されていないプラスミドを拾ったのではないかという結論に至りました。 ここの他に直接相談できる方が見つかり、結果的に皆さんのおっしゃるとおり空のプラスミドであったようです。 In-Fusionのうまくいかない原因ははっきりと分かりませんが、あまりベクターの質がよくないのではないかということでした。 かなり初心者っぷりを露呈してしまいましたが、勉強になりました。 もう少しきっちり丁寧にやり直そうと思います。 返信くださった皆様どうも有難うございました。

(無題) 削除/引用 No.3609-14 - 2010/12/06 (月) 16:46:52 - AP >ただ、今日抽出したプラスミドを再び電気泳動にかけてみたところ、2，4，6ｋｂと三箇所にバンドがありました。この６ｋｂの意味するところはどうなるのでしょうか・・。 OCはlinearより移動度がやや小さくなりますので、それに相当するといって良いと思います（どのくらい小さくなるかは条件による）。抽出されたプラスミドを泳動すると、移動度の異なる3つのformが混在し、ccc>>>linear>OCのバンドが見えるというのは、ごく普通のことです。 最近はあまり使わないかもしれませんが、抽出されたプラスミドに見られる三態、ccc, OC, linearはそれぞれ、form I, form II, form IIIと名前が付いているくらいで。

ありがとうございます。 削除/引用 No.3609-13 - 2010/12/03 (金) 15:46:58 - hono たぶん、結果的にこのベクターは空であったのだろうと思います。 APさんのcccやocのバンドを勘違いしているのではないかという説が濃厚な気がしてきました。 ただ、今日抽出したプラスミドを再び電気泳動にかけてみたところ、2，4，6ｋｂと三箇所にバンドがありました。この６ｋｂの意味するところはどうなるのでしょうか・・。 他に並行しているクローニングもあるので、これにはあまり深入りはしないでまたやり直そうと思っていますが、あまりに無知なので皆様のご意見をお聞きしたいと思った次第です。 APさん始め皆様のアドバイスによると、私がポジティブかどうか確認に使用した制限酵素やPCRに使用したプライマーが混乱を招いている原因だと思いました。 制限酵素はベクターをカットするために使用した酵素を使い、PCRプライマーもインサートを増やすために使用したものをそのまま使いました。 APさんや310さんのおっしゃるように1箇所切断する酵素や確認用のプライマーを使ってまずは確認することが一番だと思いました。 ちなみにPCRでプライマーのみのネガコンを行いましたが何もでてきませんでした。 mAbさん In-Fusion についてのお返事どうもありがとうございます。 ポジコンでは多数コロニーが得られましたので、トランスフォーメーションは問題ないと思っています。 私はPCRでシングルバンドが出てきても不安だったので、ゲル抽出をしていました。先日別の遺伝子で初めてEnhancerを使用したところ、12時間後にはコロニーが見え始めたので、下手にPCR産物をいじくり回さない方がいいのかもしれないと思い始めました。 あまり深入りしないよう気をつけます。 Actiasさん アデノさんのおっしゃるようにClontechのシステムを使っています。私の意味したシャトルベクターはアデノウイルスのゲノムを持ったベクターに入れる前に使用するpShuttle2というベクターのことです。このベクターもある意味シャトルベクターなのかなと思っているのですが、一般的に使用するシャトルベクターの定義をあまりよく分からずにこの言葉を使用していました。 まずは、ちょうど良い酵素を選んで確認したらまた報告させていただきます。お騒がせしてすみません。

(無題) 削除/引用 No.3609-11 - 2010/12/03 (金) 11:24:29 - mAb ＞大丈夫です。インサートにprimerへ付加した制限酵素サイトがないことは確認してますよね。 この指摘は間違ってました。訂正します。

(無題) 削除/引用 No.3609-10 - 2010/12/03 (金) 10:12:24 - mAb > １）このサイトでプライマーの設計をしています。ここで出てきたものをそのままオーダーしていますが、大丈夫でしょうか？ 大丈夫です。インサートにprimerへ付加した制限酵素サイトがないことは確認してますよね。 > ２）insert量を振ってみたことはありません。これもサイトででてきた適正量をそのまま使用しています。どのくらいの幅で振ってみるのが良いでしょうか？ これはPCR産物の増幅効率によります。3マイクロＬ程度のPCR産物ではっきりバンドが認められれば、プロトコル通りで問題ありません。薄い場合は相同組換え時のPCR産物添加量を増やしてみて下さい。 > 　３）ポジコンは置いていましたが、ネガコンを置いていませんでした。 ポジコンは多数のコロニーが認められましたか？　そうならば、トランスフォーメーションの工程は問題ないことになります。なお、ネガコン（ベクターのみ）は、ベクターがうまく切れていなければ、形成されるコロニー数はもっと増えると思います。 > 　４）プロトコールに沿って希釈しています。コンピテントセルの種類によっては希釈率を上げた方が良いとも書いてあるので、プロトコールより薄く希釈したこともありますが、コロニーはできませんでした。 推奨の希釈率で問題ありません。 > Cloning enhancerを使用した場合とPCR産物を抽出して行った場合、どちらも同じくらいの効率でコロニーは得られますか？ Cloning enhancerしか使用してません。どちらでも問題ないと思います。 最後に、実験失敗の原因を追究することは問題点を理解する上で非常に重要です。ただし、最近のベクターコンストラクションは派遣さんでも問題なくやってます。真理を追究するために労力を使うポイントではないと思います（語弊があったらすいません）。

(無題) 削除/引用 No.3609-9 - 2010/12/03 (金) 05:46:48 - アデノ >[Re:7] Actiasさんは書きました : > 僕は東大医科研のSwaIサイトにブランとで入れるコスミドのベクターしか、アデノのシャトルは知りませんが、「ベクター4 Kb」 ってどういうことでしょうか？ > 使っている系が違うので、言葉の定義のズレがあるのかもしれませんが、僕のいうシャトルベクターは、アデノのゲノムほぼ全長を持っている40 kb近いベクターのことです。 > 話がずれていたらゴメンナサイ。 > Clontechの製品みたいなので、この場合シャトルベクターといっているのはpShuttle2 (4.0 kbp) で、これに目的の遺伝子を入れて、認識配列がかなり特殊な制限酵素で切り出して、アデノウイルスベクター (33 kbp) に組み込み方法だと思います。 製品サイトをみるとわかりやすいかと。 一般的なシャトルベクターの意味とは違うようです。

(無題) 削除/引用 No.3609-8 - 2010/12/03 (金) 05:10:14 - 310 ベクター＋インサートの制限酵素処理の際インサートを切らずベクター内で1箇所切断する酵素で切り、空ベクターも同様にして切ります。サイズスタンダードで大きさを比べながら0.8％前後のアガロース（TAEの場合）で電気泳動すれば、4kbと6kbの違いは容易に区別できます。複数のコロニーがコンタミしていれば両方のバンドが出ます。 しかしActias様の言われている大きさのベクターですと上記の方法が使えません。私がPCRするときはインサートの有無にかかわらず増えるプライマーを使って長さの比較で、ポジネガを決めています。コンタミしてると2本バンドが出るのでこちらでも一目で分かります。

(無題) 削除/引用 No.3609-7 - 2010/12/02 (木) 22:59:37 - Actias 僕は東大医科研のSwaIサイトにブランとで入れるコスミドのベクターしか、アデノのシャトルは知りませんが、「ベクター4 Kb」 ってどういうことでしょうか？ 使っている系が違うので、言葉の定義のズレがあるのかもしれませんが、僕のいうシャトルベクターは、アデノのゲノムほぼ全長を持っている40 kb近いベクターのことです。 話がずれていたらゴメンナサイ。

(無題) 削除/引用 No.3609-6 - 2010/12/02 (木) 19:50:48 - AP 結論から言えば、クローンや精製法によらず、皆はずれ、空のベクターということなんだと思います。ですから、 >いろいろ悩むより、もう一度やり直した方が早そうです。 という意見はもっともですが、こういう失敗を体験したときに（特に初めての経験であるとき）、なぜ判断を誤ったか、錯誤の原因はなにかということを、しっかり追求しておくのは非常に大切です。そんなの良いから、さっさとやり直して結果を早く出せというのは兵隊をきりきり働かせるやりかたであって、教育的でない。 閑話休題。 いろいろな条件によりますが、おおざっぱに言って、電気泳動でcccは、同じサイズのlinearやOCの半分くらいのサイズに見えます。4 kbと2 kbがベクターとインサートに一致すると言いますが、これは空のベクターのlinear (あるいはOC）と、cccであっても矛盾しません。制限酵素消化にないものも同時に流して見ると良いでしょう。空のベクターもコントロールにすれば、cccの位置が同じが、上にシフトしているかでインサートがあるかどうかは一目瞭然。 >疑問1：抽出方法の違いによってこの違いが出たのか、あるいは偶然か。 で、精製方法や、精製の機会やキットの違いによって、結果が違うことについて、可能性が高いと思うのは、 アルカリ/SDS液（soln. III）のロット、新鮮さ、温度や時間などに違いがあって、アルカリ処理が過剰になっているのではないかと言うことです。 つまり、キットを使ったミニプレップは適正に処理されていたが、キットなしのアルカリ法、あるいはmidiキットで精製したときは過剰に処理されたんじゃないかということです。 アルカリ処理が過剰だと、cccが、部分的ではあっても解離して、プラスミド全体の二重鎖が不可逆的に「歪む」ために認識配列が制限酵素によって認識されなくなり、全く切断されなくなります。電気泳動ではほぼcccの位置に来ます。プラスミド分子の一部がこういう状態で切れのこり2 kbバンドを、大部分の正常なプラスミドはlinearに切れて4 kbバンドになったのではないでしょうか。 それとPCRでバンドがでたというのは、何かのコンタミではないでしょうか。 どのようなプライマーを選びましたか？ たとえばインサート内部から選んだ一対のプライマーなら、現にいまそのインサートDNA断片を扱っているところですから、どこかでコンタミする可能性は低くなく、そう言う場合でも正しい産物の増幅が起こるでしょう。 正しいコンストラクトが出来たときにのみ有効なPCR (ベクタープライマーとインサートプライマーのくみあわせとか、クローニングサイトをはさんだベクタープライマー対とか）でやるべきなんですが、どのようにしていましたか。

ありがとうございます。 削除/引用 No.3609-5 - 2010/12/02 (木) 17:43:20 - hono 早速のご回答どうもありがとうございます。 ~さん > どのような結果をネガティブ、ポジティブと読んでいるのですか？ 　ポジティブ：制限酵素で処理した結果、ネガティブはベクターのバンドのみ確認し、ポジティブはベクターのバンドとインサートのバンドを確認しました。 > ocとccのバンドがでて、それをベクターとインサートのバンドだと思っていたりしませんか？ もし、ocあるいはccのバンドだった場合、バンドのサイズはどのくらい違うものでしょうか？ 実は後出しで申し訳ないのですが、抽出後のベクターをそのままゲルに流した写真ではインサートとベクターのあたりにもバンドが見られ、その他のあたりはスメア状です。その写真を見て、失敗かなとは思ったのですが、改めて増やして制限酵素処理した後、しっかりしたバンドが見られたので信じてみました。この判断が間違っていたのかもしれませんが、なぜこの時点でインサートのバンドが見られるのかがよく分からず続けることにしました。 制限酵素処理後に検出できた２つのバンドは一応ベクター（４ｋｂ）とインサート（２ｋｂ）のサイズに合った場所にでてきています。 > PCRのネガコンはきちんと置いていますか？ 置いていませんでした。やり直してみます。 > どのような形で出したのですか？ > サンプルの取り違えの確認のために、残りを回収して確認することは出来ますか？ プラスミドの濃度を250ng/ul以上に調節し、水に溶かして出しました。確認は可能かと思います。 mAbさん おっしゃるとおりやり直した方が早いかもしれないです・・・。 １）このサイトでプライマーの設計をしています。ここで出てきたものをそのままオーダーしていますが、大丈夫でしょうか？ ２）insert量を振ってみたことはありません。これもサイトででてきた適正量をそのまま使用しています。どのくらいの幅で振ってみるのが良いでしょうか？ 　３）ポジコンは置いていましたが、ネガコンを置いていませんでした。 　４）プロトコールに沿って希釈しています。コンピテントセルの種類によっては希釈率を上げた方が良いとも書いてあるので、プロトコールより薄く希釈したこともありますが、コロニーはできませんでした。 In-Fusionはそんなに成功率が高いのですね・・。技術の違いでしょうか。Cloning enhancerを使用した場合とPCR産物を抽出して行った場合、どちらも同じくらいの効率でコロニーは得られますか？ In-Fusionをやめて、普通のライゲーションもやってみようと思っています。 48時間後にコロニーがたったの9個という時点でおかしかったのかもしれないです。 ネガコンは大事ですね。。

(無題) 削除/引用 No.3609-4 - 2010/12/02 (木) 13:49:54 - と 私はアデノウイルスベクターに関する知識がないので的外れな意見かもしれませんが、 ＞プレートに撒いてから48時間後にようやく9個のコロニーが得られました この48時間後というのはうまくいってもこうなるものなんでしょうか？ 例えばAmp耐性プラスミドを大腸菌にtransformする場合、48時間もインキュベーターに入れておくとプラスミドが入っていない大腸菌もコロニーを形成してしまいます。

(無題) 削除/引用 No.3609-3 - 2010/12/02 (木) 09:55:18 - ~ >キットを使用して抽出したコロニーはネガティブ、残りの5個はポジティブでした。 どのような結果をネガティブ、ポジティブと読んでいるのですか？ アルカリプレップで精製したベクターが汚くて制限酵素で切れなくて、ocとccのバンドがでて、それをベクターとインサートのバンドだと思っていたりしませんか？ >目的遺伝子を検出のためこの5個のプラスミドをPCRにかけましたが、やはりポジティブな結果となり PCRのネガコンはきちんと置いていますか？ 実はコンタミしていて、テンプレート無しでも増えたりしませんか？ >これを信用してシークエンスに出しました。 どのような形で出したのですか？ サンプルの取り違えの確認のために、残りを回収して確認することは出来ますか？

(無題) 削除/引用 No.3609-2 - 2010/12/02 (木) 09:49:55 - mAb いろいろ悩むより、もう一度やり直した方が早そうです。 In-fusionは最近採用しましたが、極めて良好な結果を得てます。 コツとしては、 １）primerの設計配列をclonetechのサイトで確認する ２）相同組換え時のinsert量を振ってみる ３）消化済みベクターのみのネガコンを置く ４）In-fusion反応後の溶液をプロトコル通りに希釈しトランスフォーメーション これまで20種類以上のコンストラクションを行いましたが、トランスフォーメーション後16時間程度でコロニーが見え、ほぼ100％でインサートが確認出来てます。

クローニングに困っています 削除/引用 No.3609-1 - 2010/12/02 (木) 07:05:45 - hono いつも参考にさせていただいています。 現在、アデノウイルスベクターの作製に挑戦しています。 クローニングは基本的な流れを一度教わりましたが、初心者です。 とある遺伝子をシャトルベクターにClontechのIn-Fusionシステムを利用して組み込んでみています。 このIn-Fusionもなかなかうまくいかず、反応させてから大腸菌にトランスフォーメーションしてプレートに撒いてから48時間後にようやく9個のコロニーが得られました。 全てを拾ってプラスミドを抽出しました。 　4個は抽出キットを使用 　5個はアルカリプレップでキットを使わず抽出 このプラスミドを制限酵素でカットしたところ、キットを使用して抽出したコロニーはネガティブ、残りの5個はポジティブでした。 　 　疑問1：抽出方法の違いによってこの違いが出たのか、あるいは偶然か。 少しこの結果に疑問があり、このポジティブ5個のうち2個のコロニーをさらに増殖させ、midiキットを使用してプラスミドを抽出し、制限酵素で確認しました。また、目的遺伝子を検出のためこの5個のプラスミドをPCRにかけましたが、やはりポジティブな結果となり、これを信用してシークエンスに出しました。 シークエンスの結果、プラスミドに遺伝子は挿入されておらず見事にシャトルベクターの配列をそのまま読んでいました。 2種類の制限酵素でカットしていたはずなのですが、カットもされておらず酵素１と酵素２の間もしっかり読まれていました。 　疑問２：可能性として、そもそもIn-Fusionをする前の段階でシャトルベクターが制限酵素でカットされていなかったことが考えられますが、その場合コロニーを得た後のプラスミドを制限酵素で確認したときやPCRでなぜ目的遺伝子のバンドが見られたのでしょうか？ 　疑問３：あるいはシークエンスがおかしいのでしょうか？ 長くなってしまったので必要な情報があれば後で書き足そうと思います。 初心者なので、足りていない部分が多々あると思いますがだいぶクローニングに行き詰っています。 何か、少しでも手掛かりが得られればと思い投稿しました。 どうぞよろしくお願いします。

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