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(無題) 削除/引用 No.3596-5 - 2010/12/02 (木) 09:32:36 - ~ >検出感度の問題なのかどうかは分かりません。単に外注先の分析データが悪いかもしれません。 これを放り出して他の方法を一から探すのはもったいないと思います。 少なくとも外注先から情報を聞くことは、今すぐできますよね。 目的の分析が出来なかったのであれば外注先選定を間違えていたのかもしれませんし、 求める実験精度を伝えていないために、求められる精度の測定をしなかったのかもしれません。 >活性触媒残基の質量が変わります これが安定な状態で変わっていることは何かデータであるのでしょうか？ それが分かる時点で、測定系が存在することになると思いますが。 TOF-MSであれば、1ダルトン以下の精度で測れますので、 水素イオンが1個出入りしても分かるはずです。 （100%の酵素が反応していなければ、2本並んででてくるでしょう） そのため、安定に質量が変わるのであれば、分析会社に分析方法を相談するのがいいと思います。 >RI Labellingも可能です。 これは、その質量が変わる部分をラベルできるということですか？ 原子が出入りしていて、補酵素か何かでその原子を供与できるということでしょうか？ そうであれば非放射性同位体入りの補酵素を使って同位体を取り込ませることで、 質量の変わったペプチドをMSで分析できるかもしれません。 （放射性同位体でも出来ますが、送付や受け入れが面倒だと思います）

(無題) 削除/引用 No.3596-4 - 2010/12/02 (木) 07:58:59 - ンンノ 酵素基質複合体がチロシンのリン酸化ならリン酸化チロシン特異抗体というもの が売られてますから、それで引っ張れるかどうかでわかりますよね。 そうでなければRIラベルして消化したペプチドをLCで分離同定すればいいと 思いますが、RIで使える実験装置が足りないということでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3596-3 - 2010/12/02 (木) 02:22:49 - みにみに おお様 ご返答、ありがとうございます。 現在、活性性残基についての情報が少なく、かなり広い範囲で探さなければなりません。反応後のタンパク質をプロテアーゼを用いて消化してからLC/MS/MSで測定しました。ペプチド断片全体のアミノ酸質量を見ているため、はっきりした質量の変化が見られませんでした。検出感度の問題なのかどうかは分かりません。単に外注先の分析データが悪いかもしれません。これに対してRIの検出感度はタンパク質の量に依存するため、比較的にコントロールしやすいです。

(無題) 削除/引用 No.3596-2 - 2010/11/30 (火) 11:42:49 - おお 今いち把握し切れないので疑問点を書きます。 活性触媒残基の質量が変わると言う事ですが、それがMSでは検出できないのならその質量変化はトランジェントでとらえ切れないように思います。それでもRI Labellingが可能というのは少し矛盾を感じるのですが、これは単に検出感度が違うからでしょうか?もしそうだとしたらRIでラベルの効率から考えて矛盾がないですか?

効率的酵素の活性サイトをマッピングする方法を教えてください。 削除/引用 No.3596-1 - 2010/11/30 (火) 08:52:47 - みにみに ある酵素の活性触媒残基を同定しようとしています。不運にPoint MutationとDeletionのタンパク質はうまく発現されず困っています。 Tyrは活性触媒残基の可能性があるので、何かタンパク質中のTyrだけを阻害するものがありますでしょうか。また、タンパク質の特定残基を分析する新しい方法と技術が分かりましたら、教えてください。活性反応を起きると活性触媒残基の質量が変わります。また、RI Labellingも可能です。 もちろんHPLC/MS/MSなどをやりましたが、いまいち結果がはっきりしませんでした。 よろしくお願いします。

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