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(無題) 削除/引用 No.3583-10 - 2010/11/30 (火) 13:24:13 - aaccbb 私はGFP-LC3ではなくEGFP-LC3をもちいていましたが、問題なく観察できました。固定は4%PFAで20分。その後PBSで3回、DWで1回洗った後Fluoromountで封入し共焦点で観察しましたよ。マニキュアで消光するということを聞いたので少し気をつけています。 EGFPとGFPの差はあるとは思いますが、観察できなくなるほどの差はないようにおもいます…。 ・固定前は蛍光顕微鏡で明確なGFP蛍光が見えてはいますか？ ・顕微鏡の使い方には問題はないですよね？ ・実験はStableですかTransientですか？ ・transfection効率も疑ってみましたか？ ちなみにtransientではautophagyにtransfection試薬の影響が出てしまうようで、stableでの実験が推奨されているようです。

(無題) 削除/引用 No.3583-8 - 2010/11/29 (月) 10:14:13 - ~ >普段IFはMetOH/Acetonや4% PFAで行っているのですが http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech3/biotechforum.cgi?mode=view;Code=2414 有機溶媒はあまりGFP向きの固定法では無いと思います。 パラホルムアルデヒドだけでもダメでしたか？ GFPの観察ではよく使われていますし、GFP-LC3を使った論文でも使われていますよね。 それで見れないのであれば、固定方法のプロトコルを聞くよりも、 実際に操作できる人に教わりに行くのがいいと思いますけど。

(無題) 削除/引用 No.3583-7 - 2010/11/26 (金) 21:28:21 - PE こんばんわ（笑） 皆様、コメントありがとうございます。 皆様、固定をしてそのままGFPの蛍光を観察されているということですよね。 固定をするとGFPの蛍光が弱まりませんか？ 普段IFはMetOH/Acetonや4% PFAで行っているのですが、この固定法で行うとGFPの光が消えてしまったので、あぁ、GFPは固定するとダメなのかと思っていたのですが。 aaccbbさんがご紹介下さった論文では3% paraformaldehyde solutionで固定して、そのままGFPを見ているようですね。 良い固定法をご存じでしたら是非教えていただけないでしょうか。

オートファジー　GFP-LC3の観察 削除/引用 No.3583-6 - 2010/11/26 (金) 18:08:36 - aaccbb GFP-LC3発現細胞はコーティングしたカバーガラス上で細胞を培養し、蛍光顕微鏡で観察していました。（共焦点です） チャンバースライドガラスは高いので私もなかなか使えませんでした。 GFP-LC3のドット状形態の数を数えるなら、そんなに高倍率で観察しなくてもよいと思いますが。10〜40倍の対物レンズでよかったと思います。 GFP-LC3の写真を載せるのも大切ですが、結局はウェスタンでLC3確認しないと信頼性は低いように思います。 PubmedID: 19200872の文献を参考にしてやりました。

(無題) 削除/引用 No.3583-5 - 2010/11/26 (金) 11:20:40 - ~ NuncのLabTekでも高倍率で見るには、枠を外してカバーグラスをかけてみますので、 目的は経時観察ではなく、1回きりの観察でいいのですよね？ オートファジーは見たことがありませんが、 私も stuさんと同じくカバーグラス上に細胞を接着させて顕微鏡写真を撮っていました。 １．カバーグラス(無蛍光)を70%エタノールに浸けておく ２．ピンセットで1枚つまみ、ガスバーナーの火で引火させ、エタノールを飛ばす ３．細胞培養用dishに重ならないように数枚入れる ４．培地をいれ、細胞を撒く ５．Dishごと、適切なタイミングで、適切な処理（固定等）をして観察できるようにする ６．グリセロール水溶液（10%位？）を垂らしたスライドグラスにそっとのせ、マニキュアで封する ほとんどは試薬、実験用のグレードのものを使っていましたが、 マニキュアは100円ショップのものを使っていました。 ラメ入りのマニキュアを使っている人もいましたが、蛍光観察でも特に支障はなかったようです。

(無題) 削除/引用 No.3583-4 - 2010/11/26 (金) 10:51:22 - stu 細胞2−3個の写真を見ただけでは、拡大してとったのか、低倍の写真を切り取ったのか判断はできないと思います。 ただ、どちらにしてもちゃんと細胞内局在を見たい場合は60倍以上のレンズは必要です。また培養ディッシュではその場合、焦点が短くて合わないので、ガラスに巻く必要があります。 金銭的に高いものがダメなら、カバーガラスに細胞を撒いて、スライドガラス上の封入して観察するほうが安価にできます。数十〜１００円ぐらいのコストで。

(無題) 削除/引用 No.3583-3 - 2010/11/26 (金) 09:33:41 - in situ IWAKIのglass based dishを使っています。 http://atg.ushop.jp/rika/hbin/gbdish.html 50個で20,000円前後ですし、nuncのものよりは安いんじゃないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3583-2 - 2010/11/25 (木) 22:31:06 - う >こんばんわ。 　　↓ こんばんは。

オートファジー　GFP-LC3の観察 削除/引用 No.3583-1 - 2010/11/25 (木) 22:17:20 - PE こんばんわ。いつも参考にさせていただいてます。 オートファジーの観察をGFP-LC3を使って始めました。 論文を読んでいても細胞2，3個を見せているくらいで、かなり強拡大だと思うのですが、うちの蛍光顕微鏡だとディッシュ上にまいた細胞では、それほどまで拡大できません。 カバーグラスタイプのLab Tekを使うことも考えたのですが、Nuncの商品は96個入りで約17万円と言われ、二の足を踏んでいます。 もっと安い商品をご存じありませんか？ 皆様はどのように観察されているか、是非教えていただけないでしょうか。

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