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(無題) 削除/引用 No.3575-4 - 2010/11/29 (月) 01:54:26 - やましー 基本的に検量線がきちんと引けていれば問題ありません。 ただ、きちんとというのは、PCR効率が2倍に近いという意味です。 PCR効率が1.8以下であればきちんと引けているとは言い難いです。 その点は大丈夫でしょうか。 TAMRAは蛍光を発するので（長波長側なのでFAMにあまり被らないと思いますが・・・）、最近はMGBがよく使用されています。 Tm値が高くなるというのも好まれている理由だと思います。 （プローブを短く出来るので） バックグラウンドが高くなる理由については、 1.クリアプレートにマジックで書き込みをしている 2.マウント部分が汚れている 3.プローブが分解している（もしくはフリーのFAMが残留している） などが考えられます。

(無題) 削除/引用 No.3575-3 - 2010/11/25 (木) 09:07:55 - ンンノ Quencherも新しいのが開発されていて旧世代よりバックグラウンドが低いと メーカーから営業を受けた事があります。 旧世代とはTAMRAのことですから、バックグラウンドが少なからずでるんでしょう。 検量線が引けてれば問題ないと思います。

うろ覚えですがレスがないようなので・・・ 削除/引用 No.3575-2 - 2010/11/24 (水) 21:44:58 - こうじ NFQ-MGBとか非蛍光クエンチャーではなく TAMRA色素だと高くなるんではなかったかな

TaｑMan PCRのバックグラウンドに関して 削除/引用 No.3575-1 - 2010/11/24 (水) 20:27:15 - たろう いつも参考にさせて頂いてます。 TaqManプローブを用いたリアルタイムPCRに関して質問させて下さい。 SYBRによるリアルタイムは何度も行っていますが、TaqManPCRは全く初めてで勝手がよくわかりません。 あるバクテリアの遺伝子を標的としたTaqManPCRを行っております。 プライマー、プローブ共に新規に設計しました。 純培養した標的菌からDNAを抽出し、段階希釈して検量線作成用に使用しています。PCR機はABI7900で、プローブは5'-FAM、3'-TAMRAです。 プライマーに関しては、SYBRの系で特異的な増幅を確認しています。 TaqManPCRを実施したところ、サイクル数０の時点でかなり高い蛍光（Rnが１以上）が観測されました。 サイクル数の進行に伴って、Rｎの増加は確認できました。 △Rnで解析すると、きちんと検量線も作成できます。 お聞きしたい点は以下です。 TaqManプローブはクエンチングにより最初は蛍光を発しないのだと思っていたのですが、かなり高いRｎが最初から観測されます。 これは、通常そういうもの(消光しきれない蛍光が検出される)でしょうか？ SYBRの場合は、当然最初はRnは0に近く、そこからサイクル進行にともなってRnが急増しますよね。 TaqManの場合は、サイクル進行に伴うRnの増加(△Rnの増加)で検量線が書ければ、最初の蛍光が強いことは問題ないのでしょうか？ 初心者質問で申し訳ありません。ご回答をよろしくお願いします。

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