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(無題) 削除/引用 No.3569-16 - 2010/11/26 (金) 14:49:40 - 中年 二本鎖にした後、変性→アニーリングをすると、変異のある箇所はミスマッチになりますので、ミスマッチ結合タンパク質mutSと混合してゲルに流すと、変異を含まない二本鎖のみが本来の位置に泳動されるので、それを回収するというトリックもあります。 www.nippongene.com/pages/products/clomod/mod_e/taqmuts/muts02.html

みなさまありがとうございます。 削除/引用 No.3569-15 - 2010/11/25 (木) 22:34:58 - 詰まれてる 精製グレードが高いオリゴを注文しようと思います。 購入した製品って、100%信頼できるわけじゃないんですね。

(無題) 削除/引用 No.3569-14 - 2010/11/25 (木) 09:45:25 - ばいや APさん ありがとうございます。 勉強します

(無題) 削除/引用 No.3569-13 - 2010/11/25 (木) 01:33:47 - ンンノ 質問の内容だと２０塩基のオーバーラップのある５０塩基くらいのを２本合成 してフィルイン（って言うのかな？）してるみたいです。 多くても３０クローンくらい拾えばアタリもありそうな気がするけど。 フィルインの反応条件や精製がまずくて変異を導入してる可能性はないかなと 思いました。識者の皆様、いかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3569-12 - 2010/11/24 (水) 18:52:57 - AP その方面のことに詳しくはないのですが、たまたま見ていた論文によるとPCAと言う方法があるそうです。 ttp://www.pnas.org/content/101/44/15573.abstract ttp://www.pnas.org/content/100/26/15440.abstract その方法でサービスを提供する会社もあるようです（じつは論文よりこっちの方を先に見つけた）。 ttp://www.oligos.com/

(無題) 削除/引用 No.3569-11 - 2010/11/24 (水) 17:28:46 - ばいや ついでの質問ですが、人工遺伝子合成ではどのような合成方法をしているのか知っている人がいれば教えて欲しいです。とてもキロbp単位で合成しますよね。

(無題) 削除/引用 No.3569-10 - 2010/11/24 (水) 15:17:36 - AP 合成機の性能も日進月歩でしょうけれど、ご存じでしょうが、化学合成によるヌクレオチド伸長は100% エラーフリーではありません。だいたい、一塩基伸ばすごとに1%のエラーがあるといいます。多くはヌクレオチド付加のミスで、一塩基スキップしてしまう欠失ですが、伸長が止まってしまう場合や塩基置換、挿入も（たぶん、機会の不調だとか、ステップの繰り返しが非常に多い長鎖の合成では過重がおこるなどし、ステップごとの基質の交換が完全ではないとかで）あるようです。 20-30 ntくらいだと、1, 2塩基短いのはかなり混じっていますが、ポピュレーションとしては少ないので、脱塩程度の精製で多くの用途に使えますが、80くらいの長鎖になると、完全な配列をもった分子はかなりすくないはずです。少なくともPAGE精製は必要で、できたらMSなどで品質チェックしたいところです。 あるていど長いオリゴはPAGE精製で供する（脱塩ではださない）というメーカーも多いと思うんですが。脱塩で出荷している会社は、自前で必要な精製をするという前提でだしているんじゃないでしょうかね。

(無題) 削除/引用 No.3569-9 - 2010/11/24 (水) 13:16:53 - ザンギ 配列確認に手間とコストをかけるくらいなら、オリゴのグレードを奢るほうが 安上がりですね。 でも、オリゴの合成ミスで置換や挿入って起こりうるんでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3569-8 - 2010/11/24 (水) 13:01:37 - Pumpkin >bpが増すと脱塩だけじゃ不十分なんでしょうか これがすべての元凶だと思います。

(無題) 削除/引用 No.3569-7 - 2010/11/24 (水) 13:01:04 - モモ 私の同僚もI社で合成エラーを経験してます・・・

(無題) 削除/引用 No.3569-6 - 2010/11/24 (水) 12:03:24 - 詰まれてる >>amiさん やはり、bpが増すと脱塩だけじゃ不十分なんでしょうかね。 >>Pumpkinさん 確かにその方が、制限酵素処理もいらないですし、確実ですよね。 検討してみます。 >>APさん 精製グレードの検討をしてみようと思います。 >>中年さん 注文先は、◯nvitorogenなんですが、たまにはあることなんですかね。 クレームのメールして対応をみてみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.3569-5 - 2010/11/24 (水) 10:17:23 - 中年 合成後の脱保護が不十分であるせいだと思います。合成元にクレームしてみては？

(無題) 削除/引用 No.3569-4 - 2010/11/23 (火) 21:56:01 - AP 合成オリゴDNAから出発しているなら、合成エラーが原因かと思います。 5'側にエラーが多いのは、固相合成が3'→5'で進められるということと関係あるかも（後の方がエラーが入りやすい？）。 合成メーカーを変えるとか、合成グレード、品質チェックのグレードの高いものにするとか。 あるいは、長い合成オリゴほどエラーが入りやすいので、相補配列を介してオーバーラップする30 ntくらいのオリゴ数本で全長をカバーするとか。

(無題) 削除/引用 No.3569-3 - 2010/11/23 (火) 21:53:38 - Pumpkin コンストラクトを早く作りたいなら、センスもアンチセンスも合成してアニーリングしたものをベクタに組み込んだらいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3569-2 - 2010/11/23 (火) 21:48:43 - ami プライマーの品質って結構そういう実験では大事。低い精製グレードとか、低い品質の会社（ぉ）とかでは、１０個に２個くらい変異入ってたりする。

変異がどうしても入ってくる 削除/引用 No.3569-1 - 2010/11/23 (火) 21:43:58 - 詰まれてる プラスミドベクターの構築を行っています。 80bpほどのオリゴをDNAポリメラーゼで二本鎖（インサート）にして、ベクターとともに制限酵素処理（EcoRI、Not Iでダブルダイジェスチョン）して、ライゲーション、形質転換し、コロニーをいくつか拾ってシークエンスを見ています。 しかし、ポリメラーゼで二本鎖にしたインサートにいくつか変異が見られます。塩基が変わってる事も有りますし、塩基が導入されてることもあります。変異の入り方に決まった規則性はありませんが、入り易いところはあるみたいです（５’の方に多いです）。 なにか同様な実験をしてるかたで、同じことを経験し、解決できたかたはいらっしゃいますでしょうか？ もしくは、なにか心あたりがあるかたいらっしゃいますか？ よろしくお願いします。

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