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訂正しました 削除/引用 No.3568-15 - 2010/11/23 (火) 23:27:31 - 初 ami様、ぽ様、TK-1様、A様、AP様 みなさま、丁寧なご回答ありがとうございました。 ライゲーション溶液：コンピテントセルは1：10の比で行っています。 今回は、プラスミド精製後の形質転換の際についての疑問になります。 私の経験や知識不足が多くあり、大変申し訳なく思っています。 色々な事項について考えたり、疑問を解決しながら取り組みたいと思います。 数々の貴重なご意見、ありがとうございました。 ンンノ様 訂正しました。 今、バイオ実験イラストレイテッドが手元にあるので、勉強したいと思います。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3568-14 - 2010/11/23 (火) 23:10:57 - ンンノ >ライゲーション溶液：コンピテントセルは１０：１の比で行っています。 え？ 一度実験入門書に目を通されるといいかと。 形質転換レベルの基本的なテクニックについては、ラボごとの作法より 成書のほうが洗練されてます。 バイオ実験イラストレイテッドとか、数千円の価値は十分にあります。

(無題) 削除/引用 No.3568-12 - 2010/11/23 (火) 22:22:14 - AP 特定の断片のクローニングのような場合、DNAの総量（濃度）はあまり気にしませんね。コロニーが一個であろうと、1万個であろうとあたりが取れればいいのですから。 プラスミドugあたり10^8形質転換体のコンピートセルだとすれば、ライゲーションプロダクト中に有効なプラスミドが0.1pgでもできていれば、数十個のコロニーが得られます。逆に1 ngあったとしてもコロニーの数が多くなるだけで、取れるものに自体違いがあるわけではありません。 問題は、ライゲーション反応中にどれだけ有効なプラスミドができているかは、予測できないということですが、まあ、これくらい入れとけば、最低でも数個は出るだろうというラインを上回っていればいいでけです（私はベクター数ng以上のライゲーション産物であればよいと思っています）。 数が多けりゃいいというものでない、シングルコロニーを取るのに適当なDNA量というものがあるだろうという意見はあると思いますが、プレーティングする量を調節すればいいだけです。私は、多めに（回復培養液の1/4-1/2程度）を一枚の培地にプレーティングします。均一にまくと数が多すぎてシングルコロニーの単離が難しくなるので、プレートの半分はかすれるようにスメアします。これで、コロニーが多い場合でも、少ない場合でも一発で単離できます。

(無題) 削除/引用 No.3568-11 - 2010/11/23 (火) 21:54:52 - A あ、すいません。 >プラスミドだと多すぎですがライゲーション溶液とコンピテントセルだと >10:1の比でやってますね。それがごっちゃになっているのでは？ もちろん ライゲーション溶液：コンピテントセル＝1：１０です。

(無題) 削除/引用 No.3568-10 - 2010/11/23 (火) 21:53:25 - A プラスミドだと多すぎですがライゲーション溶液とコンピテントセルだと 10:1の比でやってますね。それがごっちゃになっているのでは？

(無題) 削除/引用 No.3568-9 - 2010/11/23 (火) 21:19:56 - TK-1 菌10に対して、2までは入れても効率はそれほど変わりません。 コロニーが出過ぎるのが困るのであれば、transformationのあとの菌を薄めて複数のプレートにまけばいいと思いますが。

(無題) 削除/引用 No.3568-8 - 2010/11/23 (火) 21:05:30 - ぽ 菌10が少ないからDNA多くしとけばちょうどよくなるんじゃないですか？ うちは菌100にDNA2ぐらいですけど

思ったんですけど 削除/引用 No.3568-7 - 2010/11/23 (火) 18:59:16 - ami 菌10ulにDNA液1ulって多くないですか？

(無題) 削除/引用 No.3568-5 - 2010/11/23 (火) 18:57:55 - 初 そ様、Pumpkin様 ご意見、アドバイスありがとうございました。 本や検索で調べていたのですが、考えていると混乱してきたので質問させていただきました。 形質転換効率を求める際は、プラスミド濃度を出して計算して求めるにも関わらず、今まで形質転換の際はサンプルの濃度に関係なく10：1で行っていました。形質転換効率の高いコンピテントセルを用いれば、同じDNA濃度でも多くコロニーが生えました。 濃度が高い場合は希釈して使用すれば、希釈したものと原液をストックすることもできますし、プラスミドの濃度が高すぎる場合に一つの大腸菌に対して複数のプラスミドが入ってしまうこともあるのではないかと思っていました。そうなると、今後に影響はあるのかないのかすごく疑問でした。 また、コロニーが数十個〜数百個生えるようDNA量を調整してくださいと記載されているものもあれば、DNA量を決定しているプロトコルなどもありました。なので、自分が行っている形質転換は単純に10：1でしか考えていなかったので悩んでいました。 今の時点ではコロニー数が多すぎるという問題はないので、今後形質転換を行う際は、濃度を検討して調整したいと思います。 今回のことをきっかけに、きちんと考えて取り組んでいきたいと思います。 貴重なご意見ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3568-3 - 2010/11/23 (火) 17:30:55 - Pumpkin >いい加減な量で行ってまったく問題ないからです。 コンピの形質転換効率からどのくらいのプラスミド量でどのくらいのコロニーが出るかを把握されている方はいいですけど、最初くらいはきちんと押さえるべきですよ。シングルアイソレートできないくらいにコロニーがでても困るでしょうよ。 >DNA濃度や量については、何も聞いていません。 自分で考えたことがないなら、ちゃんと一回考えてください。言われたことしか出来ない、考えない人間にならないでください。 また、DNA断片のクローニングではベクターとフラグメントのインサート比は検討したほうがいいですよ。特に長鎖のフラグメントは。

(無題) 削除/引用 No.3568-2 - 2010/11/23 (火) 15:40:20 - そ 形質転換を厳密なDNA量で行うことはあまりないと思います（エレクトロポレーションは良く知りませんが････ いい加減な量で行ってまったく問題ないからです。mini preなんかでとったDNAを1〜2μ入れておけばまず問題ないはずです。

形質転換について 削除/引用 No.3568-1 - 2010/11/23 (火) 15:23:21 - 初 初歩的な質問で申し訳ないのですが、形質転換について質問があります。 私の所属している研究室では、共通のプロトコルがほとんどありません。 私が先輩から習った方法は、コンピテントセル(JM109,BL21(DE３)など)１０μlに対してDNAを1μlを使いて、そのあとヒートショックを行うというものです。DNA濃度や量については、何も聞いていません。 今まで希釈をしたことがなく、抽出したDNAを原液のまま使用しているので、サンプルによってDNA量は違ってしまいます。 今後、グリセロールストックの作製やタンパク質発現を行う予定なのですが、形質転換の際のDNA量が多くても影響しないのでしょうか？ 適切なDNA量や方法がありましたら、教えていただきたいです。 よろしくお願い致します。

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