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(無題) 削除/引用 No.3555-14 - 2010/11/24 (水) 13:25:00 - prota 自分で書いておいてなんですが、一つの考え方として、生理的な条件がなんで、とかややこしいことを考えなくても、何らかの条件で結合してくるのであれば、生理的にも結合する可能性がある、ということは間違ってないとも思います。所詮、IPやプルダウンでは、結合するということは言えても、しないということは言えないわけで。

(無題) 削除/引用 No.3555-13 - 2010/11/24 (水) 11:17:47 - NASUBI >免沈なら、その時点で、もう細胞内の話ではなく、抗原抗体反応、免疫沈降の条件の話！！！です。 それは単に、抗原抗体複合体形成の至適条件の問題であって、生理的条件下で目的のタンパク質が複合体を形成しているかという点を確認するのであれば、免沈の条件も、細胞内のイオン濃度にあわせるべきではないのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3555-12 - 2010/11/23 (火) 13:00:59 - たぶん ＞正確には、細胞質内のタンパク質の解析（免沈）をするとき、 免沈なら、その時点で、もう細胞内の話ではなく、抗原抗体反応、免疫沈降の条件の話！！！です。 厳密に言えば、抗原抗体反応でもイオン条件依存の反応がある（プラスいろいろな抽出条件などなどがある）ので、千差万別で、いろいろな論文で自分の条件を使っても相手も条件をつかっても再現しないことがあるのは有名です。 いちいち条件を変えるのは面倒なので、一定のバッファー（TBST, NaClを含む)など使うのが普通。１４０ｍMか１５０ｍMとかもほとんど意味がないとおもいますけど。ある程度の塩濃度がないと抗体認識に支障がでることがある（非特異的になる）と聞いた事がありますが、免疫の専門家のかたどうでしょう？

(無題) 削除/引用 No.3555-11 - 2010/11/22 (月) 23:40:17 - prota 失礼しました。一つの理由は、膜タンパクを含む場合は、細胞外環境にあるタンパクも考慮する必要があり、どちらにしてもイオン的に至適にはならないので、なんとなくNa+にしてる、という場合が多いのではないでしょうか。 膜を可溶化する場合には、イオン強度が生理的条件がベストとは限りません。そもそも膜の可溶化とは生理的ではないわけで。界面活性剤によっては生理的イオン強度の数倍高い場合もあります。本当は、それぞれの実験の目的に合わせて可溶化液の組成を振らないといけないのですが、そこまでしてる人はあまりいないですね。実習書に書いてあったから、誰かの論文にあったから使ってるという人が大多数と思います。たしかに厳密に考え出すときりがないというのはありますが、やっこさんの疑問はとても大事です。

(無題) 削除/引用 No.3555-10 - 2010/11/22 (月) 23:27:37 - ATGC いや、別にKClでやってもいいんだよ。単に始めた人がたまたまNaCl使ってやって、それでうまくいってたから、みんなあまり考えず真似してるだけでしょ。KCl使ってる人もいるよ。SDSとの結合が気になるなら最後の洗いの一番最後だけKClの代わりにNaClつかえばいいわけだし。KCl入りbufferの残液の持ち込みくらいならSDSと混ぜてもあまり問題ないと思う。蛋白質実験は基本的にケースバイケースが多いからオリジナルのprotocol内容はあくまで自分の実験に合わせて選択、必要に応じて改変するのがいいとおもうけどね。IPは塩濃度が低いとビーズへの非特異吸着が多い気がするから、150mM NaCl/KClは下限でもう少し高い方がいいかも。あと核蛋白質だと150mMくらいでは可溶化出来ないもののほうが多いと思う。だからもしそうなら0.5Mとかにしないと。

トピの内容 削除/引用 No.3555-9 - 2010/11/22 (月) 21:40:00 - やっこさん すいません。誤解を与えまして・・・ トピの内容が不適切でした。 正確には、細胞質内のタンパク質の解析（免沈）をするとき、 なぜ、lysis bufferを、Ｋ＋ 、１４０ｍＭではなくて、 Ｎａ＋、１５０ｍＭにするのか？ Ｋ＋では何か不都合が生じるので、Ｎａ＋にしているのか？ と言う質問です。

ありがとうございます。 削除/引用 No.3555-8 - 2010/11/22 (月) 21:28:29 - やっこさん 皆様、お答えをいただきまして心から感謝します。 細胞内外のそれぞれの塩濃度の濃度は 細胞外：Ｎａ＋、１５０ｍＭ、Ｋ＋ 、１０ｍＭ 細胞質内：Ｎａ＋、１０ｍＭ、Ｋ＋ 、１４０ｍＭ くらいですから、細胞質内でAとBが複合体形成をするかを、 lysis bufferの塩濃度をＮａ＋、１５０ｍＭとした場合と Ｋ＋ 、１４０ｍＭとした場合で、それぞれ免沈してみました。 結果は、Aの抗体でちゃんとAタンパク質は同程度落ちてきましたが Ｎａの場合に比べてＫの場合は、若干、共沈するBが少ないくらいで 何の問題もなく落ちてきました。 prota様のご指摘のように、Ｋ＋ 、１４０ｍＭは細胞内でのタンパク質の 共沈ではより生理的な条件に近いですので、どうしてlysis bufferを、この条件にしないのか？何が不都合なのか、わかりません。 界面活性剤がK＋では機能しにくくなるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3555-7 - 2010/11/22 (月) 13:18:22 - prota これは難しい問題です。細胞内ではK+がNa+と等価くらいにあるので、細胞質内の反応を再構成するためには、K+を0.13Mくらいにして、Naを、やっこさんの書かれたように10ｍMにするのが、一番生理的な条件に近いです。たいへんデリケートな反応の代表であるタンパク質合成系では、それくらいのイオン比が一番合成量が高くなります。ただ、陰イオンも問題で、Cl-は細胞質では低いので、これを他の陰イオンに置き換えないといけないわけで、また、２荷イオンも大きな影響があるので、それも考慮する必要があります。 あるいは、界面活性剤との組み合わせで膜の可溶化力も変わってくるのでそれも振って、というわけで、たくさんパラメーターがあり、ちゃんと考えて実験しようとすると、自分の目的に合わせていろいろと条件を決める必要があります。普通にIPしても、塩がKか、Naかで、共沈してくるタンパクのパターンが微妙に変わったりすることもあります。

(無題) 削除/引用 No.3555-6 - 2010/11/22 (月) 10:21:56 - yyy 人間の正常な血清中（細胞外液）Na濃度は135mM位で他の陽イオン濃度を含めれば大体150mMで近似出来るのではないでしょうか？　浸透圧的にはNa＋Clになるので300mMはやや高めですが、Cell-freeの系だと大きな問題にはならないのでしょう。

(無題) 削除/引用 No.3555-5 - 2010/11/22 (月) 09:26:47 - う 細胞外液のNaは150mEqと関係あります？

(無題) 削除/引用 No.3555-4 - 2010/11/22 (月) 05:53:04 - あかね 細胞内の塩濃度は10mMではありませんよ。

(無題) 削除/引用 No.3555-3 - 2010/11/22 (月) 04:40:54 - たぶん すでにお答えがあるのに類似しますが、塩濃度が低いと、不溶性画分にモノが非特異的にくっついて抽出に不具合があるということかと。

(無題) 削除/引用 No.3555-2 - 2010/11/22 (月) 04:04:46 - yyy ある程度の塩濃度が維持されないとタンパクの構造や相互作用に狂いが生じるからではないでしょうか？　陽イオンであればNaでもKでも多くの場合はそれ程違いはないだろうし、KはSDSと沈殿を生じるから、Lysateを即サンプルにしたい場合は不都合が生じるのでは？

lysis bufferの塩濃度が高いのはなぜ？ 削除/引用 No.3555-1 - 2010/11/22 (月) 03:52:22 - やっこさん すいません。超ビギナーです。 細胞を可溶化するときのlysis bufferは150 mM NaClになっていることが多いですが、細胞質内のNaCl濃度はNa-Kaポンプで、10mM程度なのに、どうして lysis bufferを10mM程度に調整しないのでしょうか？ 教えてください。

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