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(無題) 削除/引用 No.3549-7 - 2010/11/20 (土) 08:52:37 - 蜜柑 すみません、付け加えるのを忘れてました。 >poreサイズが大きい透析膜を使えば、SDSは抜けます。 透析膜を見たらporeサイズは14,000でした。十分SDSを抜くことができる大きさですが、いかんせんSDSは溶液にナトリウムイオンがいる状態＋低温だと析出してしまうらしいのです。 やはり室温で透析を回すしかないのでしょうか… しかし分解が…

(無題) 削除/引用 No.3549-6 - 2010/11/20 (土) 08:12:13 - とおりすがい PierceからSDSを除くカラムが出ています。 http://www.piercenet.com/products/browse.cfm?fldID=02050702 ただ同様なものを以前使った同僚に聞くと、効果は無くはないけれど、それほどよいものでも無さそう、とのことでした。

(無題) 削除/引用 No.3549-5 - 2010/11/20 (土) 07:59:28 - 蜜柑 >溶出させるのは駄目なんですか？ まだ試したことがないのでなんともいえないのですが、どの程度でSDSあるいはタンパク質が溶出するのか不明ですし、ロスが心配なのでカラムはできれば避けたいです。 >切り出してそのあとは何を目的とされているかに寄りますが 抽出したタンパク質は濃縮した後、細胞に加える予定です。なので最終的にはPBSに溶けている状態にしたいのですが、濃縮する際にSDSがかなり出てしまうと思われ、濃縮前の前処理みたいな感じで透析を行いたいのです。 >SDSと相性のよい尿素（6M尿素/PBS）に対して室温で透析 >最後のところで、変性沈殿する可能性が大きいです やはり室温で透析を回すしかないのでしょうか…細胞に加えてその影響を見たいので、できればタンパク質が分解していない状態で使いたいのですが… 沈殿はある程度覚悟しています。今までも違う方法で精製してて、透析を行うと沈殿できることが多々ありましたし。

(無題) 削除/引用 No.3549-4 - 2010/11/19 (金) 22:53:41 - qq millさんの言う通り、クローメタが簡単だと思いますが、 透析にこだわるのなら、SDSと相性のよい尿素（6M尿素/PBS）に対して室温で透析します。2回程度、外液を交換して、SDSをできるだけ除去します。 その後、尿素を除去するために、室温、もしくは低温でPBSに対して透析します。 いずれにしても、最後のところで、変性沈殿する可能性が大きいです。

(無題) 削除/引用 No.3549-3 - 2010/11/19 (金) 22:15:18 - mill 切り出してそのあとは何を目的とされているかに寄りますが、このあと、濃縮されずそのまま酵素処理などをされるのであれば、３でもOKです。単純にSDSの変性作用を押さえるからです。懸念されておられるとおり、1はロスる可能性が高く、また、ゲル濾過も途中で凝集することも多いので、同じ問題があります。ただ、濃縮されるのならば、Tritonも一緒にされるので、それが問題になることもあります。 SDSを抜きたいだけなら、もしタンパクの分子量がSDSミセルの分子量（１８ｋDa)よりもずっと大きいなら、poreサイズが大きい透析膜を使えば、SDSは抜けます。室温で透析しても普通使われる膜はpore sizeが1万程度なので、SDSはよほど長時間しないと抜けません。ただいずれにしても、SDSが抜けるにつれてタンパクは凝集する可能性が高いです。 プロテアーゼ消化などだったら、沈殿させた方が早いです。クロロホルム−メタノール法を使えば高い収率が得れます。他にもSM-2ビーズでSDSを抜く手があります。透析の時と同じ問題がありますが。

(無題) 削除/引用 No.3549-2 - 2010/11/19 (金) 22:06:51 - と ＞�@は目的のタンパク質も陰イオン交換カラムに吸着するため 溶出させるのは駄目なんですか？ ゲルろ過のロスと室温での透析の悪影響のどっちが大きいかを実際にやって調べるとか・・・・・

SDS-PAGEを用いたタンパク質抽出後のSDS除去 削除/引用 No.3549-1 - 2010/11/19 (金) 20:33:03 - 蜜柑 いつも拝見させて頂いております。 タンパク質の精製について困っています。 SDS-PAGEを行った後に欲しいタンパク質のバンドを切り出し、それをElectro-Eluter(BIO-RAD Model 422)なるものでタンパク質の抽出を行ってます。 抽出液にはタンパク質と共にSDSが含まれており、SDSを除く必要があります。4℃下でPBS透析を行ったところ、SDSと思われる結晶が透析チューブ内に析出してしまい、SDSを抜くことができません。 (後から析出して当然だと知りました…) 説明書には対策として (1)陰イオン交換カラム (2)ゲルろ過クロマトグラフィー (3)泳動バッファー(25mM Tris 192mM Glycine 0.1% SDS)に0.5% Triton X-100を加える などと書いてありましたが、�@は目的のタンパク質も陰イオン交換カラムに吸着するため、�Aはロスが心配で行うことが出来ません。 そこで質問です。 �@(3)のTriton X-100を加えることでどういう原理でSDSが除けるのか �Aゼラチンザイモの要領で透析bufferにTriton X-100を加えて効果があるのか �BほかにSDSを除去する方法はあるのか 先生にはSDSが析出しない温度(室温)で透析するように言われましたが、タンパク質なので分解が心配です。 ご存知の方、いらっしゃればご回答頂けると幸いです。

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