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HeLa ecotropicへのレトロウイルス感染 トピック削除
No.3547-TOPIC - 2010/11/19 (金) 12:44:09 - HeLa
いつも勉強させていただいております。
現在、HeLaにmCAT（マウスレトロウイルス受容体）をstableに発現させた細胞を用いて、PLAT-Eで作製したecotropic virusを感染させる実験を行っております。

しかし、実際にウイルスをかけた24時間後、全ての細胞が剥がれ死滅してしまいました。

感染させたレトロウイルスによりtoxicな蛋白を発現させたわけではなく、
感染「操作」により死滅したんだと考えております。というのもlipofectionではGFP単独にものと、GFP融合タンパクを発現させた場合とでは導入効率は変わらなかったためです。

このEcotropic virus感染用HeLaは私の所属するlabの方が作製されたもので、過去その方はその細胞を利用してecotropic virusを問題なく感染させておられました。

みなさまにお聞きします。
現在、その細胞へ、PLAT-Eで作製したウイルスを感染させる際に、polybrane 3 ug/mlで24 hr
感染させていますが、全て12h以内に死滅しました。私自身他の細胞へのretro virus感染はルーチンに行っておりますので、非常に困惑しております。今後、polybraneの濃度検討や、virusの量を検討せねばならないのかなと考えております。

そもそもこの場合polybraneは必要なのかも確信がありませんが、、

みなさまのご意見を頂けますと幸いに存じます。
どうぞ宜しくお願いします。
　
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(無題) 削除/引用
No.3547-8 - 2010/11/20 (土) 21:59:48 - HeLa
stu様

ご意見ありがとうございます。

また、ウイルス量をふって、再度検討してみます。
ありがとうございました。

(無題) 削除/引用
No.3547-7 - 2010/11/20 (土) 21:41:48 - stu
なぜ多重感染しないと言われているのかわかりませんが、通常のやり方で（platEとかのパッケージング細胞を利用）多重感染しないということはないと思います。

例えば、iPSなんて、まさに多重感染しないとできなかったはずですから。

なぜ感染しすぎた細胞が死んでしまうのか、正確なことはわかりませんが、
イメージとして、細胞内に多量すぎるウイルスが入ってきたら、通常の転写や翻訳まで阻害されてしまったり、細胞膜などがボコボコになってしまうのかなと思ったりします。

(無題) 削除/引用
No.3547-6 - 2010/11/20 (土) 18:31:29 - HeLa
stu様、あ様

ありがとうございます。
やはり感染が良すぎると死んでしまうこともあるんですね。
amphoは、危険性の大きさから避けています。

１つお聞きしてもよろしいですか？
実験医学の遺伝子導入に関するプロトコル本に、レトロは多重感染しない、と書かれてあります。
current protocolにもそう書かれてあります。

これはどういったことなんでしょうか？
実際は多重感染は起き、それによって今回はおそらく死んでしまったかと思っています。

(無題) 削除/引用
No.3547-5 - 2010/11/20 (土) 13:53:47 - あ
前の方と同じですが、ウイルスを薄めて行ったらどうでしょうか。

amphoropicやVSV-Gを使わないのは理由があるのでしょうか。。。HeLaなら効率よく入りますよ。polybrane 3 ug/ml、24 hrでHeLaは死なないと思います。

コントロール足りない 削除/引用
No.3547-4 - 2010/11/19 (金) 21:28:52 - ami
ポリブレンだけとか。ウィルス希釈とか。ウィルス産生させてないPLATE培養上清とか。他いろいろ。

(無題) 削除/引用
No.3547-3 - 2010/11/19 (金) 18:09:00 - stu
１、感染効率が良すぎる場合に、細胞が死んでしまうことはあるそうです。
感染効率のかなり良いレトロウイルスであれば、希釈して行ってみてはどうでしょう。

２、ネガコンに普通のHelaを置いた場合はいかがでしょう。それでも死滅するのであれば、ウイルス上清になにかコンタミしているのでは。


３、GFPも入っていないベクターでの感染はいかがでしょう？

４、後輩が行ったことある単純ミスは、ウイルスを作る際にウイルス上清にpuromycinを入れていたことがあり（platEをpuro+blustで培養しているので）、そのままpuro入りウイルス液で感染させて、細胞が死んでました。

(無題) 削除/引用
No.3547-2 - 2010/11/19 (金) 13:34:00 - れとろ
polybrene添加して細胞と一日incubateすると、確かに死にそうな気がします。なぜそんなに長くされておられるのでしょう？表面に荷電を与える（というか中和する）以外の目的？普通、前処理かと思いましたが。

HeLa ecotropicへのレトロウイルス感染 削除/引用
No.3547-1 - 2010/11/19 (金) 12:44:09 - HeLa
いつも勉強させていただいております。
現在、HeLaにmCAT（マウスレトロウイルス受容体）をstableに発現させた細胞を用いて、PLAT-Eで作製したecotropic virusを感染させる実験を行っております。

しかし、実際にウイルスをかけた24時間後、全ての細胞が剥がれ死滅してしまいました。

感染させたレトロウイルスによりtoxicな蛋白を発現させたわけではなく、
感染「操作」により死滅したんだと考えております。というのもlipofectionではGFP単独にものと、GFP融合タンパクを発現させた場合とでは導入効率は変わらなかったためです。

このEcotropic virus感染用HeLaは私の所属するlabの方が作製されたもので、過去その方はその細胞を利用してecotropic virusを問題なく感染させておられました。

みなさまにお聞きします。
現在、その細胞へ、PLAT-Eで作製したウイルスを感染させる際に、polybrane 3 ug/mlで24 hr
感染させていますが、全て12h以内に死滅しました。私自身他の細胞へのretro virus感染はルーチンに行っておりますので、非常に困惑しております。今後、polybraneの濃度検討や、virusの量を検討せねばならないのかなと考えております。

そもそもこの場合polybraneは必要なのかも確信がありませんが、、

みなさまのご意見を頂けますと幸いに存じます。
どうぞ宜しくお願いします。
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