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(無題) 削除/引用 No.3540-12 - 2010/11/24 (水) 10:42:21 - KCl 濃縮ゲル＋分離ゲルというスタンダードなゲルを作製してNative PAGEを行いました。分離ゲルの組成はそのままで、濃縮ゲルの組成はアクリルアミド濃度2.5%+Tris-HClpH6.8を使用しました。 その結果、分離ゲルと濃縮ゲルの間付近で目的のタンパク質のバンドが見られました。この場合、タンパク質が流れていないと判断すればよいのでしょうか？それとも、凝集している可能性を疑うべきでしょうか？酵素ではないタンパク質なので活性測定を行ったりはできません。 BN-PAGEの他に泳動に用いる緩衝液を変えると泳動が上手くいくそうなので、そちらも検討してみようと思いますが・・・

(無題) 削除/引用 No.3540-11 - 2010/11/19 (金) 14:27:06 - qq >BN-PAGEはG-250のCBBを使うとありますが、R-250ではどうしてダメなのでしょうか？もしお分かりでしたら、ぜひ教えてください。 質問の意図が汲み取れません。 「どうしてR250ではダメなのか」は、ありえない質問です。 G250を使う理由なら、幾らか挙げることができると思います。 そんなこと、ご自身でBN-PAGEのマニュアルや、原著を探してください。

(無題) 削除/引用 No.3540-10 - 2010/11/19 (金) 14:04:19 - KCl >[Re:9] qqさんは書きました : > 界面活性剤でハマると結構痛いので、BN-PAGEの方が良いかもしれません。 > > BN-PAGEはG-250のCBBを使うとありますが、R-250ではどうしてダメなのでしょうか？もしお分かりでしたら、ぜひ教えてください。

(無題) 削除/引用 No.3540-9 - 2010/11/18 (木) 21:43:31 - qq 界面活性剤でハマると結構痛いので、BN-PAGEの方が良いかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3540-8 - 2010/11/18 (木) 14:49:10 - AP 一概にどの界面活性剤がいいかとは言えないと思いますが、カジュアルにはTriton-X100とかTween-20なんかが試してみやすいのではないでしょうか。 たまたま見つけたこのページに、アグリゲーションの問題も含め、Native PAGEの問題が論じられていました。 http://www.ap-lab.com/native_gels.htm 最後の文献のところに出ているこの論文では、Tween80の検討を行っています。 http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/(SICI)1520-6017(200005)89:5%3C646::AID-JPS10%3E3.0.CO;2-J/abstract

(無題) 削除/引用 No.3540-7 - 2010/11/18 (木) 14:38:14 - BNPAGE おすすめの界面活性剤はn-Dodecyl-beta-D-MaltosideかDigitoninですね。 Digitoninの方がよりマイルドです。 あとTriton x-100を使ってる論文も見たことがあります。 界面活性剤の種類や濃度によってＣＢＢ染色のパターンもかなり変わってくるので、濃度検討は必須です。

(無題) 削除/引用 No.3540-6 - 2010/11/18 (木) 13:16:13 - KCl >[Re:5] APさんは書きました : > >泳動バッファーは25mM Tris-HClと250mMグリシン。 > これは間違い>ないですか？　 すみません。ご指摘どおり、Tris-HClではなく、Trisの間違いです。 > pIが5ならこれより高いpIのバッファー中ではちゃんと正電荷があるはずですね。 > 疎水性が強いため、疎水結合でアグっているのかもしれません。非イオン性の界面活性剤を加えたらどうでしょう。 > > 非イオン性の界面活性剤を使うという方法は知りませんでした。お勧めの界面活性剤とかありますでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3540-5 - 2010/11/18 (木) 09:32:42 - AP >泳動バッファーは25mM Tris-HClと250mMグリシン。 これは間違いないですか？　HClは余計なんでは。 もし本当にこの組成だったとしたら、泳動がおかしなことになると思います。 >タンパク質の計算上のpIは5付近で、疎水性が強いという性質をもっており、電荷が少ないのかもしれません。 pIが5ならこれより高いpIのバッファー中ではちゃんと正電荷があるはずですね。 疎水性が強いため、疎水結合でアグっているのかもしれません。非イオン性の界面活性剤を加えたらどうでしょう。

(無題) 削除/引用 No.3540-4 - 2010/11/18 (木) 00:18:33 - あらにん >[Re:3] qqさんは書きました : > 膜タンパク質ということですか？ 膜タンパク質ではありません。ただ、濃縮とかすると沈殿しやすいので、あまり可溶性が高くないのではと考えています。 >[Re:2] BNPAGEさんは書きました : > Native-PAGEの場合、目的のタンパク質が正電荷を強く持っていると逆向きに泳動されることもあるようです。 > 私はタンパク複合体にCBBでマイルドに負電荷を持たせて泳動する、Blue Native-Pageという方法でやってます。 Blue Native-Pageはやったことがないですが、ぜひ検討してみたいと思います。これならば、電荷の心配がなくなりますね。

(無題) 削除/引用 No.3540-3 - 2010/11/17 (水) 22:18:38 - qq ＞タンパク質の計算上のpIは5付近で、疎水性が強いという性質をもっており、電荷が少ないのかもしれません。 膜タンパク質ということですか？ 膜タンパク質であれば、何らかの界面活性剤をゲルの中にいれておかないと、ゲルに入るところで、不溶化してしまう可能性が高いです。

(無題) 削除/引用 No.3540-2 - 2010/11/17 (水) 22:14:46 - BNPAGE Native-PAGEの場合、目的のタンパク質が正電荷を強く持っていると逆向きに泳動されることもあるようです。 私はタンパク複合体にCBBでマイルドに負電荷を持たせて泳動する、Blue Native-Pageという方法でやってます。 ゲルからバッファーまで全てInvitrogenのキットを買って使ってますが、特に困ったことはないです。

Native PAGEで流れない 削除/引用 No.3540-1 - 2010/11/17 (水) 21:33:27 - KCl Native-PAGEについてですが、タンパクが上手く流れませんでした。 泳動後、ＣＢＢで染色しますと、ゲルの一番上のウェルの部分が青く染色されており、泳動されていないようでした。 上手く泳動するためにはどのような点を変更すればよいか悩んでいます。 泳動条件は、 7.5%アクリルアミド濃度でｐＨ8.8、濃縮ゲルは作製せず、分離ゲルだけのゲルとしました。 泳動バッファーは25mM Tris-HClと250mMグリシン。 サンプルバッファーはGlycerol+BPB+Tris-HCl pH6.8。 低温室で、10mA/gelで4時間泳動し、ＣＢＢで染色しています。 タンパク質の計算上のpIは5付近で、疎水性が強いという性質をもっており、電荷が少ないのかもしれません。 アドバイスをいただければ幸いです。よろしくお願いします。

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