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(無題) 削除/引用 No.3516-10 - 2010/11/14 (日) 15:09:47 - Tom >>サンプル中にJNK1のmRNAが存在しているのかどうか、RT-PCRなどで確認してみてはいかがでしょうか? 私のラボは遺伝子を調べたり出来ません。ですのでウエスタンでしか検出出来ないラボになります。 >>実験動物種やStrainも同じなのですよねぇ。 論文でラットの組織を用いた論文を色々見ましたが、私の使っているwistar系と同じものかは確認していません。 早急に確認したいと思います。 今まで色々な論文を見ている中で、JNKのバンドが一本のみの論文もありました。ですので私の結果も間違いではない可能性もありますね。 もう少し文献調査して見ます。

(無題) 削除/引用 No.3516-9 - 2010/11/14 (日) 13:12:57 - TS １．トータルJNK1のバンドも出ない ２．ほかの組織ではJNK1/2、pJNK1/2両方出る、 というあたりから、手法自体は大きな問題となっていないと考えてよいと、私は思います。（より美しいブロットを得るために改善する、というのは常に必要ですが） ほかの論文では2本とも出ているということですが、複数の論文を確認されたのですよね？ 実験動物種やStrainも同じなのですよねぇ。 問題解決のための建設的なコメントができませんが、 とぴ主さんの動物の心臓ではそういうものなのでは？と思ってしまうところです。

(無題) 削除/引用 No.3516-8 - 2010/11/13 (土) 22:19:08 - ファイト! >>使用されているタンパクは何になりますでしょうか？ マウス血球系細胞株です。 >>洗いの時間を短くすることでバンドが検出されるようになるってことはよくあるのでしょうか？(リン酸化タンパクの検出以外にも中々検出が困難な場合) 洗いの時間を短縮=それまで検出できなかったバンドを検出、という経験はないですが、抗リン酸化抗体に限らず、洗いの時間や回数、震盪を激しく行えば、露光にそれだけ時間がかかるようになるので、それなりに抗体を洗い落としていると思います。 でも、洗いをきつくした方が、バックグラウンドが下がり、仕上がりは綺麗になるので、自分が見たいバンドの濃さと天秤にかける感じですね。 ただ抗リン酸化抗体の場合は、洗いの条件を厳しくしないほうが良いです。 　少し気になるのですが、前のコメントに >ちなみにトータルのJNK1/2もブロットしたのでしょうか？　それで発現レベルの違いはわかると思います。 トータルの方は検出しているのですが。 とは言っても54kDaの方(JNK2)のみしか確認できていません。 とあります。 サンプル中にJNK1のmRNAが存在しているのかどうか、RT-PCRなどで確認してみてはいかがでしょうか?

(無題) 削除/引用 No.3516-7 - 2010/11/13 (土) 11:43:21 - Tom ファイト！さん >>その際に、担当者から 1. TBSTを使用していますか? 2. 各Washは5分×3回行っていますか?(洗いすぎはシグナルを弱めます) と確認されました。 メンブランの洗いにはTBSTを使用していますので問題なさそうですね しかし洗いは10min×3で行っているため、次回は是非そうさせていただきます 思ったのですが、洗いの時間を短くすることでバンドが検出されるようになるってことはよくあるのでしょうか？(リン酸化タンパクの検出以外にも中々検出が困難な場合) また、ファイト！さんが使用されているタンパクは何になりますでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3516-6 - 2010/11/12 (金) 22:49:32 - ファイト! 　つい先日経験した事です。 　2006年購入のCell Signaling社の抗体(JNK以外)を使用したところ、 ノンスペだらけで目的のバンドが特定出来ませんでした。 そこで、CST(Cell Signaling Technology)ジャパンに電話相談した所、 「製造後2年以内の使用を想定しています。 なお、抗体の凍結融解を避けるため、-25℃以下の保存は避けてください。」との回答を貰いました。 　その際に、担当者から 1. TBSTを使用していますか? 2. 各Washは5分×3回行っていますか?(洗いすぎはシグナルを弱めます) と確認されました。 　結局、私の場合は、抗体を購入し直して上手く行きました。 (前の商品は既に廃盤となっており、現在後続品が2種類販売されていたので、担当者の方に使用細胞を伝えてアメリカの本社まで問い合わせてもらい、翌日電子メールで回答をもらいました。) 　Tomさんの場合、使用期限orトランスファーに原因がある感じですが、 上記2点も再確認して下さい。 　余談ですが、つい先日、別フリーザーで保管してあった SAPK/JNKリン酸化抗体#9251S(2005年)を使用しましたが、 こちらは問題なく使用できました。 　ご参考になりますと幸いです。

(無題) 削除/引用 No.3516-5 - 2010/11/12 (金) 19:53:33 - Tom >>その論文も心臓の論文なんですか。そうだとして、同じ抗体を使っていますか。 心臓で、しかも同じ抗体を使っています。 今気付いたのですが、抗体は１０年？くらい前の物のようです(私のラボの)

(無題) 削除/引用 No.3516-4 - 2010/11/12 (金) 19:37:30 - 中年 その論文も心臓の論文なんですか。そうだとして、同じ抗体を使っていますか。 心臓にはJNK3が発現しているようですし、抗体の認識するエピトープによってはこちらを強く認識するということもあるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3516-3 - 2010/11/12 (金) 19:19:17 - Tom >>二本のバンドは、JNK1と2ですよね。 そうですね >>ちなみにトータルのJNK1/2もブロットしたのでしょうか？　それで発現レベルの違いはわかると思います。 トータルの方は検出しているのですが。 とは言っても54kDaの方(JNK2)のみしか確認できていません。 論文ではJNK1,2いずれも発現していますし，この時点で何かおかしいのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3516-2 - 2010/11/12 (金) 12:23:55 - TS 二本のバンドは、JNK1と2ですよね。 これらは、刺激によって片方だけがリン酸化されたり、両方がリン酸化されたり、と言うことがあると思うのですが。 刺激剤によるリン酸化の違い、あるいは両者の発現レベルの違いではないのですか？ ちなみにトータルのJNK1/2もブロットしたのでしょうか？　それで発現レベルの違いはわかると思います。 CSTのデータシートを見ても、サンプル（細胞）によっては、かなりの違いがあるようですよ。 脳ではうまくできているわけですし、心臓ではそういうものではないのでしょうか。

ウエスタンブロッティングでリン酸化JNKの検出 削除/引用 No.3516-1 - 2010/11/12 (金) 10:54:45 - Tom 現在心臓でのリン酸化JNKの検出を行っているのですが、思った位置にバンドが出ずに困っています。 正常心と不全心でリン酸化JNKの変化を見たいと思っています(心不全ではリン酸化JNKは増加することが多く報告されています)、。 心臓のホモジネートを40μgアプライしてポジコンとしては脳のホモジネートを流しています。 脳では46と54kDa付近にバンドが検出されます。 しかし心臓では脳の54kDa付近よりほんの少しだけ高い位置にバンドが検出されるのですが、脳の46kDa付近のバンドの高さでは心臓のバンドは全く検出されませんでした。 心臓のホモジネートにPhosstopを加えていますので脱リン酸化を阻害しているはずなのですが不全心でリン酸化JNKが検出されません。 リン酸化JNKのウエスタンをしてる論文を検索してるとバンドがばっちり2本出ています。ですので私の実験にどこか改善の余地があるのではと考えています。しかし、それが何なのかはわかりません。ですので皆様のご意見を伺おうと考えております。 使用している抗体：cell signaling Phospho-SAPK/JNK(Thr183/Thr185) #9251 Blocking：5％BSA よろしくお願いいたします。

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