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(無題) 削除/引用 No.3514-9 - 2010/11/13 (土) 17:42:26 - MBB >AP様 やはり通常のAcONaでのEtOH沈殿ではdNTPの除去は難しいのですね。 勉強になりました。 >real-time様 貴重な情報ありがとうございます。 考えて見れば当たり前の方法なのでしょうが、全然気づきませんでした。

(無題) 削除/引用 No.3514-8 - 2010/11/13 (土) 13:42:52 - real-time MBB様 トランスイルミネーターの上にラップをしいて、薄めたエチブロと量が分かっているdsDNAを段階希釈した溶液を混ぜ、数十ulずつスポットします。測りたいPCR産物も同様に薄めてラップの上に液滴をのせ、写真をとり比較して濃度を測ります。昔、未精製のPCR産物やゲノムDNAを測るときに良く使っていた方法です。結構感度が高いので、量の少ないDNAを測定するのに役に立つと思います。 ＞EtOH pptでmono-nucleatideを除去するためのテクニックとして、使用する＞塩として終濃度2.0-2.5 MのNH4OAcを使い、これを2回繰り返せば99%除去で＞きるというのがあります。 これも昔やっていたのですが、プライマーまで除去しようとしたのと手技の問題か収率が数十％以下でした。でも私の扱っていたPCR産物では、PEG沈よりは若干回収率が良かったような気がします（これはDNAの大きさのせいかも？）。

(無題) 削除/引用 No.3514-7 - 2010/11/12 (金) 12:14:38 - MBB >プライマーはssDNAなのでEtBr染色では染まりにくいですよ。 そういえばそうでした。一応PAGEでprimerを一緒に流しておいたのですが それはうっすらと見えました。とりあえずそれよりは少なくなっているはず ですが、UVでの定量を阻害するだけの量はあるかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.3514-6 - 2010/11/12 (金) 12:12:30 - AP EtOH pptでmono-nucleatideを除去するためのテクニックとして、使用する塩として終濃度2.0-2.5 MのNH4OAcを使い、これを2回繰り返せば99%除去できるというのがあります（原著はかのOkayama & Bergらしい）。 逆に言うと、普通にEtOH pptをしても効果的でないということ。

(無題) 削除/引用 No.3514-5 - 2010/11/12 (金) 11:39:12 - 中年 プライマーはssDNAなのでEtBr染色では染まりにくいですよ。

(無題) 削除/引用 No.3514-4 - 2010/11/12 (金) 11:29:10 - MBB ご回答ありがとうございます。 EtOH沈殿に書かれている書籍に、沈殿するのが8bp〜との記載があるので モノマーは殆ど除かれるのかと思いましたが、そういうわけでもない ということですね。primerについてはバンドが見えていないので PCRで殆ど消費されたのではないかと思います。

(無題) 削除/引用 No.3514-3 - 2010/11/12 (金) 11:10:38 - 中年 > あるいはEtOH沈殿でも多量のdNTPが残存していてUV吸収を強くしている > だけなのでしょうか？ その通りです。ちなみにプライマーも沈殿しているます。

(無題) 削除/引用 No.3514-2 - 2010/11/12 (金) 11:06:32 - ~ PCR産物を90ng流しても見れなくて、900ng流してやっと”マーカーと同じくらいの蛍光が見れた”という現象なのですよね。 ご自分で書かれていて、違和感を感じませんか？ >100bp markerと同程度の蛍光が検出されました。 このマーカーの100bpのバンドは何ng分流したのですか？ タカラの製品で標準の使用量であれば50ngで、他社製品もそのくらいではないでしょうか。 マーカーのバンドの蛍光は見れているのですよね。 もちろんそのバンドはDNAのはずです。 つまり、PCR産物がよほど特殊な配列でEtBrが入り込まないなどといわない限りは、 >100bp程度の短鎖DNAのEtBr染色における感度 はマーカーで確認できています。 nanodropの測定値の方を疑うべきかと。 （機械の問題なのか、目的の配列以外も拾ってしまっているのかは書かれている情報からは分かりませんが）

核酸の鎖長とEtBr染色 削除/引用 No.3514-1 - 2010/11/12 (金) 10:12:50 - MBB お世話になります。 約130bp程度のPCR産物をEtOH沈殿後nanodropで吸光度を測定したら 約180ng/uLとして濃度が提示されました。 そこでこのサンプルを1/10希釈した溶液5uLについてPAGEを行い、 EtBrで染色しました。その結果バンドが検出されませんでした。 そこで原液5uLについてPAGEを行ったところ、100bp markerと 同程度の蛍光が検出されました。 ちなみにゲルの濃度は20%です。primerのバンドは検出されませんでした。 そこで質問なのですが、100bp程度の短鎖DNAのEtBr染色における 感度はここまで低いものなのでしょうか？ あるいはEtOH沈殿でも多量のdNTPが残存していてUV吸収を強くしている だけなのでしょうか？ まわりに相談しても「おかしいね」とか「わからない」としか 答えがないので、皆様よろしくお願い致します。

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