み様
返事が遅くなり申し訳ありません。
まず、第一点目の細胞数についてのご指摘ですが、
私の使用している細胞は2.5×10^5 cell/wellで
24時間後におよそ50〜70%あたりになります。
そこそこ隙間がある状態でございます。
もちろん、個々人で感覚が異なりますのでバイアスがありますね。
次に、前者を受けて栄養が足りていないというご指摘についてです。
Colon26をオーバーコンフルにさせてメディチェンをせず
何日キープできるか検討したことがございます。
その際、最短でも3日はもつことを確認していますので、
栄養不足ではないと考えています。
最期にリバースにこだわる理由についてですが、
リバースにこだわる理由は、siRNAで標的遺伝子をKDした際、
再現性の良い結果を得ることができました。
その経験のため、強制発現系でもより良い再現性が
得られるのではないかと思い実行しています。
また、最初のトピックには記載しておりませんでしたが、
リバーストランスフェクション6時間後に
メディウムチェンジを行った事がございます。
それはOPTI-MEMでトランスフェクションした場合はOPTI-MEMで
serum freeであればserum freeで行いました。
しかし、やはりトランスフェクション後24時間で細胞が死滅しました。
また、OPTI-MEM、serum freeでも細胞が生き続けられる事は確認済みです。
このような、状況下でございます。
み様のおっしゃる通りストレートの導入で確固たる
プロトコルを作成するのが最も良いですね･･･現状がこの有様なので。
ただ、今回このリバーストランスフェクションで
どうしても解せなかったのは、
細胞数の違いで何故毒性が確認されてしまうのか･･･
しかも細胞数が多い方で起こるのは何故か
という事でした。
この事について理由づけができれば、
これからの実験でのプロトコル作成に生かせるかなぁ
っと感じております。
今回、み様のご指摘で過去の細胞毒性が確認された状況と
多くの問題点について否定するための実験を行った事を
確認する事ができました。
本当にありがとうございました。
また、情報が足りず、み様がご指摘されたことを
立て続けに否定するような形になり申し訳ございません。
また、他にポイントがありましたらお知らせください。 |
|
このスレッドをはてなブックマークに追加