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(無題) 削除/引用 No.3505-9 - 2010/11/12 (金) 22:47:46 - キックザレッグ AP　様 PEG8000は以前、試してみたのですが、収量がよくなかったのでその時点でgive upしました。再度、試してみる価値はあると思われました。2 M LiClは知りませんでした。情報いただきありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.3505-8 - 2010/11/12 (金) 22:45:16 - キックザレッグ ザンギ 様 High Pure PCR Product Purification Kitのことを指しているかと思われますが、以前、がん関連遺伝子の検出に用いた折には問題なく検出できました。ただし、コスト面から汎用しているわけではありませんし、あらゆる場面で問題ないかどうかは自信はありませんが。

(無題) 削除/引用 No.3505-7 - 2010/11/12 (金) 12:57:50 - AP ・2 M LiCl中で遠心してRNAを選択的に沈殿させる。ただし、低分子量のRNAは沈殿しないので、RNase処理はしない方がいいでしょう。 ・0.6 volの20% PEG8000/2.5 M NaClを加えて遠心してDNAを回収する。プラスミド精製法の応用で、この場合はRNase処理した方がいいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.3505-6 - 2010/11/11 (木) 23:24:42 - ザンギ Rocheのキットを使ったことがありませんが、PCR Product用で長いゲノムDNAを ちゃんと回収できるんでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3505-5 - 2010/11/11 (木) 22:39:38 - キックザレッグ ~ 様 High Pure PCR Product Purification Kitを使用すべきですね。試薬能書なども読みました。ありがとうございました。 ema様 ご教示いただきありがとうございました。次世代シークエンスでもこのような操作が必要なのですね。参考になりました。 Pumpkin様 酵素カクテルは検討に値すると思いました。RNaseIIIは確かにそうですね。とても参考となる情報をありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3505-4 - 2010/11/11 (木) 15:24:15 - Pumpkin RNaseAはCとUの間を切断しますが、RNaseIはA,U,G,C全ての間の塩基を切断します。またRNaseT1はGのあとを切断します。 一般的にRNAを分解除去するときにはRNaseAを用いますが、トピ主さんのように０にしようとすると、酵素カクテルなんかも視野にいれてもいいかもしれませんね。どのようなアプリケーションに持っていきたいのかわからないのであくまで、提案として受け止めてください。 Ambionでは、RNase Cocktail Reagentを販売しています。 Fermentasでは、RNaseA/T1 Mixを販売しています。 比較的長いdsRNAが含まれる場合はRNaseIIIを使う必要があるでしょう。 ~さんが書かれているように分解産物のrNTPとかオリゴリボヌクレタイドはカラム精製の段階で除去できそうです。

レベルと手順 削除/引用 No.3505-3 - 2010/11/11 (木) 11:48:17 - ema 通常のシークエンスレベルではそこまでしない事も多いですが、マイクロアレイ・次世代シークエンス用はかならすRNaseA処理をしています。 カラムキットを標準仕様なのか、フェノール抽出で行ってるかでどこで使用するか異なりますが カラムならキットプロトコールに、細胞溶解時にRNaseAをいれて（オプション記載かも）カラムをかけてしまうのでほとんど除去できているはずです。 フェノール系なら、、、とはいえ面倒な時はエタチン前のエタチン前の水層回収ステップのどこかでRNaseいれてしばらく置いて、エタ沈でも結構きれいになってます。標準はエタチン後のTEもしくは水溶解でかけるのかもしんないけど。

(無題) 削除/引用 No.3505-2 - 2010/11/11 (木) 09:18:49 - ~ RNaseAも除去するのであれば、High Pure PCR Product Purification Kitも使うのでは？ どの位の純度が求められているのでしょうか？ 何か目的の操作が出来る程度に費用対効果を考えて処理したいのか、 いくら金をかけてもいいから純度を上げたいというのかでは、 やり方は変わってくるでしょう。 High Pure PCR Product Purification Kitだと、 <100 bpのDNAフラグメントの回収率は5%未満と書かれていますので、 分解されたRNAモノマーの混入率もそれ以下でしょう。 それでは要求される純度には達しませんか？ (未満と書かれていますが、実際はかなり低いレベルだと思います) http://www.roche-applied-science.com/pack-insert/1732668j.pdf

核酸溶液からRNAを除去する方法 削除/引用 No.3505-1 - 2010/11/11 (木) 00:16:40 - キックザレッグ 基礎的な質問で大変恐縮です。 培養細胞から核酸を抽出し、その溶液からRNAを除去し、DNA溶液とする方法をどなたかご教示ください。出来る限りDNAのみの溶液とし、それ以外のものは除去したいです。 ラボにあるRNase Aを用いて処理後、Roche社のHigh Pure Template Purification Kitでclean upしようかと考えております。 RNase Aのみでよいのでしょうか？反応後のRNAはこの方法で除去することが可能でしょうか？ 以上、よろしくお願いいたします。

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