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(無題) 削除/引用 No.3484-4 - 2010/11/06 (土) 17:39:23 - ATGC Nrf2って転写因子と思うんだけど、sERとかにもあるのかな？わかんないけど、取りあえず細胞質と核には存在するとおもう。２つ以上の画分に存在するかもしれないし分画で逃してしまうこともあるから、取りあえず、まずはホールライゼート（肝臓を最終濃度で2~4%のSDS入りの適当なbufferでホモジナイズして超音波処理でDNAきって、粘性なくしてから20Cくらいで12000xg、10分程度の遠心して不溶物除いてその上清使えばいいとおもう。ホモジナイズbufferは使う組織重量の20倍〜30倍量くらいあったほうがいいかもね。あとSDSあるからbufferにカリウム塩は入れない方がいいよ。）でみてみるのがいいのではないかな。（経験では、たいていの蛋白質はホールライゼートでもちゃんと見えるけどね。存在量がものすごく少ないものでなければいけるとおもうけど。あるいはNrf2はかなり少なくてホールライゼートではみえないということなのかな。）それで見えなければ分画すればどうかな。このとき始めから特定の分画にしぼってしまうと大事な事を見落とす危険大だから、一応（少なくとも始めは）先入観持たずに各分画もれなくチェックしたほうがいいとおもう。細胞内のいくつかの分画をシャトルするようなものはとくに要注意。 べつに組織サンプルの蛋白のウェスタンと細胞のそれとで何か決定的な違いがあるわけではなくて、量的な問題をのぞけば基本的な取り扱いは変わらないとおもってやってる。細胞分画の仕方は細胞と組織（組織でも各組織ごとに違う。）では少し違うところがあるからこれは成書を参照して下さい。

(無題) 削除/引用 No.3484-3 - 2010/11/06 (土) 17:08:16 - Actias nuclear factor erythroid 2-related factor 2 が細胞内のどこにいるかという質問ですね？ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/4780 だと、cytoplasm、 cytosol、nucleus http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/18024 だと、 cytoplasm、 nucleus と記載されています。 核タンパクだけど、場合によって局在が変わるのだと思います。 あらかじめ、免疫染色で場所を決めてからの方が良いのでは？ 経験者の書き込みを待ちましょう。

Nrf2の精製方法について 削除/引用 No.3484-2 - 2010/11/06 (土) 11:05:10 - wakana おはようございます。いつもお世話になっております。 生体内からNrf2をある程度で構わないのですが、精製したいと考えています。どなたか精製方法をご存知の方がおられましら、アドバイスをよろしくお願い致します。

inviviでのwestern blotting を用いたNrf2測定 削除/引用 No.3484-1 - 2010/11/06 (土) 10:51:13 - ASKA おはようございます。いつも適切なアドバイスをありがとうございます。 今日も質問がありまして、お時間がありましたらよろしくお願い致します。 本研究において、in vivoにおいて試料を摂取させることで、解毒代謝系酵素を誘導させたラットの肝臓を用いて、Nrf2のwestern blotting を行いたいと思っています。しかし、多くの論文では細胞を扱ってのwestern blotting が多く、in vivoでのwestern blotting を行っているという情報があまりありません。実験操作の予定と致しましては、「肝臓を破砕」→「遠心分離(105000g)での細胞質画分およびミクロソーム画分」→「各画分を硫安分画し、タンパク質を出来るだけ細分化」した後に、これらの画分を電気泳動し、Nrf2の抗体でwestern blotting を行おうと考えています。 そこで質問なんですが、Nrf2は細胞質画分およびミクロソーム画分どちらに含まれているのでしょうか？ また、in vivoで実際にNrf2の発現をwestern blottingで見る方法をご存知の方、よろしければアドバイスをお願い致します。

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