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(無題) 削除/引用 No.3455-4 - 2010/11/01 (月) 23:50:53 - ATGC なんか今思い出したけど、共通試薬のSDSは結構ヤバかった。特に古いのは。 いろんなひとがいろんな風に扱ってるし、スパーテル中に入れたりとかいろいろあるから。SDSは蛋白質溶かすから余計はいりやすい。

(無題) 削除/引用 No.3455-3 - 2010/11/01 (月) 23:37:32 - out 昔、グリセロールの安いのを使ってて出てきたことがあります。高いgradeのに代えたら消えました。ケラチン抗体だからでるのかな、と思いましたが、植物のでも反応するんですかね。ureaにとかしてblotというのはやることもありますが、大抵は問題ないです。

(無題) 削除/引用 No.3455-2 - 2010/11/01 (月) 22:38:58 - ATGC 植物のケラチンって初めて聞いたけど、動物のケラチンは分子量50~60KDaくらいだね。ケラチンは毛髪、皮膚、体毛などどこにでもあるので、どんなに気をつけててもどうしても入る。特に意識してケアせずに使っている共通buffer類とかは結構入るし、ガラス板とか電気泳動の器具には少しぐらい洗っても付いてる。これから寒くなると静電気でホコリとか付気安いのでもっとはいりやすい。 普通は気がつかないけど、ウェスタンだから、感度が高いので見えてしまうのだとおもう。LC-MS/MSとかやるとすごい感度が高いので、普通の感覚でサンプル作るとケラチンのペプチドたくさん検出される。 ケラチンはゼロには出来ないけど、減らす事は出来る。本来の見たい蛋白質のシグナルが十分強ければ短時間のexposeでよいので、それで解決出来るのだけれどそれが無理ならば、手袋して使用前にガラス板を良く洗って、サンプルバッファーも用事調製して、できれば既製ゲルを使うとある程度抑えられる。 抽出bufferや試薬が汚れてるかもしれないので、新品の尿素買い直して手袋して作り直した方がいいかも。使用する水も、容器に溜めてたものでなくて、新鮮なMQ水使うように。基本的にみんなが使ってる空けてから時間のたってそうな試薬はできるだけ避ける。

尿素バッファーについて 削除/引用 No.3455-1 - 2010/11/01 (月) 21:33:40 - ティガー 教えてください。 今、植物タンパク質を尿素バッファーで抽出し、SDS-PAGEで流してケラチン抗体でwesternblotを行っているのですが、50kDa付近にどうしてもバンドが出てきます。 出るはずのない位置なのです。 試しに、タンパクの抽出をしないで、バッファーだけ流してwesternをしてもバンドが出てきます・・タンパクがあるはずのないバッファーなのに。 尿素バッファーで抽出した後は、２×SDSを加えてSDS化をさせるのに加熱しています。これのカルバミル化が原因なのでしょうか？？ それとも、ただ単にコンタミとして考えていいのでしょうか？？ または根本的に、尿素バッファーで抽出したものをwesternすることがいけないのでしょうか？？ 何かわかる方、教えてください、お願いします。

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