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Lentivirus濃縮方法(滅菌しなくて大丈夫?) トピック削除
No.3453-TOPIC - 2010/11/01 (月) 05:19:17 - 落ちこぼれの大学教員
現在、Lentivurusを使い始めたのですが濃縮について質問です。

過去のトピックを参考にさせて頂いて、PEIによるトランスフェクションの後にPEGによる濃縮を計画しています。
以下のトピックで教えて頂いたPEG溶液の作成ですが、作成した後に滅菌するのはどうすれば良いのでしょうか？
フィルター滅菌でしょうか？それともオートクレーブ？
馬鹿な質問で申し訳ないのですが、教えて頂けますでしょうか？



[Very high titre lentivirusの作成法]
http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech3/biotechforum.cgi?mode=view;Code=2321

[レトロウィルス作成について]
http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech3/biotechforum.cgi?mode=view;Code=2275

[教えて頂いたPEG溶液作製法]
混ぜ方、大事です。HEPESが永遠に溶けなくなります。
Preparation of 4x PEG solution.
2.1Mark a line of 500 mL volume on a beaker or a flask.
2.2320 mL of 50% PEG 6,000 are prepared.
2.340 mL of 5M NaCl
2.420 mL of 1M HEPES
2.5Mix step 2.1 to 2.3 solution.
2.6Adjust the pH to 7.4 by NaOH (1M NaOH 5-10 mL)
2.7Fill up to the line of 500 mL by water.
　
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有り難うございます 解決済み 削除/引用
No.3453-6 - 2010/11/01 (月) 11:01:41 - 落ちこぼれの大学教員
皆様、早速レスポンス頂きまして有り難うございます。
下手な実験で難航しておりますが、試させて頂こうと考えます。
まずは御礼まで。有り難うございました。

(無題) 削除/引用
No.3453-5 - 2010/11/01 (月) 10:00:27 - あべちゃん

> [教えて頂いたPEG溶液作製法]
> 混ぜ方、大事です。HEPESが永遠に溶けなくなります。
> Preparation of 4x PEG solution.
> 2.1Mark a line of 500 mL volume on a beaker or a flask.
> 2.2320 mL of 50% PEG 6,000 are prepared.
> 2.340 mL of 5M NaCl
> 2.420 mL of 1M HEPES
> 2.5Mix step 2.1 to 2.3 solution.
> 2.6Adjust the pH to 7.4 by NaOH (1M NaOH 5-10 mL)
> 2.7Fill up to the line of 500 mL by water.

このステップの最後にオートクレーブすればいいです。分離してしまうので、オートクレーブした後によく混ぜてください。一回混ぜれば、再分離することはないです。

(無題) 削除/引用
No.3453-4 - 2010/11/01 (月) 05:53:19 - おお
PEG以外のバッファー成分は2Xとか5XとかでpHを合わせておいて滅菌すれば
いいかと思います。こっちはフィルターでもオートクレーブでもいいのでは
ないかと、、、

で滅菌水をつかってファイナルの溶液にすればいいとおもいます。

あるいはバファー成分は加えるPEGの容量を差し引いた量の水で
メスアップして滅菌後PEGを必要料加えるだけでもいいかと。

なるほど 削除/引用
No.3453-3 - 2010/11/01 (月) 05:31:00 - 落ちこぼれの大学教員
早いレスポンス有り難うございます。
確かに50% PEGなど溶液を別々に調整、オートクレーブすれば問題ないですね。
ただ、pHを合わせる必要があるので、出来ればその後にオートクレーブしたいところなのですが..。

(無題) 削除/引用
No.3453-2 - 2010/11/01 (月) 05:26:55 - おお
イーストでPEGつかったトランすフォーメイションのほうほうがありますが、
オートクレーブがプロトコールで推奨されていました。むかし細胞の融合実験を
したことがありますがこれもPEGをつかい、オートクレーブで滅菌していました。
50% PEG のストックをオートクレ-ブすればいいのかとおもいます。
フィルターでもいい(場合によっては理想的)かもしれませんが、分子量がおおきいとフィルターを溶液が通過しにくくなり困難です。

Lentivirus濃縮方法(滅菌しなくて大丈夫?) 削除/引用
No.3453-1 - 2010/11/01 (月) 05:19:17 - 落ちこぼれの大学教員
現在、Lentivurusを使い始めたのですが濃縮について質問です。

過去のトピックを参考にさせて頂いて、PEIによるトランスフェクションの後にPEGによる濃縮を計画しています。
以下のトピックで教えて頂いたPEG溶液の作成ですが、作成した後に滅菌するのはどうすれば良いのでしょうか？
フィルター滅菌でしょうか？それともオートクレーブ？
馬鹿な質問で申し訳ないのですが、教えて頂けますでしょうか？



[Very high titre lentivirusの作成法]
http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech3/biotechforum.cgi?mode=view;Code=2321

[レトロウィルス作成について]
http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech3/biotechforum.cgi?mode=view;Code=2275

[教えて頂いたPEG溶液作製法]
混ぜ方、大事です。HEPESが永遠に溶けなくなります。
Preparation of 4x PEG solution.
2.1Mark a line of 500 mL volume on a beaker or a flask.
2.2320 mL of 50% PEG 6,000 are prepared.
2.340 mL of 5M NaCl
2.420 mL of 1M HEPES
2.5Mix step 2.1 to 2.3 solution.
2.6Adjust the pH to 7.4 by NaOH (1M NaOH 5-10 mL)
2.7Fill up to the line of 500 mL by water.
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