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(無題) 削除/引用 No.3446-8 - 2010/11/04 (木) 19:01:30 - コンタミ太郎 No.3446-7 匿名 様 ありがとうございます。 ホスト株として検討したいと思います。 やはり種をまたぐと効率が下がることがあるんですね。 話では聞いたことがあったのですが、実体験を聞くことができて 参考になりました。 私は勉強不足でしたが、色々なホストがあるようですね。 ホストについて詳しく調べてみます。

(無題) 削除/引用 No.3446-7 - 2010/11/04 (木) 15:06:04 - 匿名 コンタミ太郎様　はじめまして。 私はBACライブラリーを作ったことはないので素人の意見になります。 以前、異なる菌間でプラスミドを行き来させるような実験をしていたのですが、高純度でスーパコイルのプラスミドを導入しても導入効率が非常に低いことがありました。当然、同種の菌間では高効率で導入可能で、菌種をまたぐような導入時にトラブルが頻発しました。何かメチル化等の修飾が邪魔をしているのかも知れないと思いました。 これは推測に基づく話ですので蓋然性に乏しいかもしれませんが、 メチル化が邪魔をしていると仮定すると、メチル化の違いに基づく切断酵素を全く欠くコンピテントセルが売られているので役に立つかもしれません。 以下のようなものです。 http://www.takara-bio.co.jp/goods/bioview/pdfs/57_16-17.pdf 最初に書きましたようにBAC素人ですので、あくまでもご参考程度ということで。

(無題) 削除/引用 No.3446-6 - 2010/11/04 (木) 14:34:49 - コンタミ太郎 Actias様 ＞20000取れるものが100、乱暴に計算するとゲノムの99.5% がそういう領域？それは考えにくい。よって、手技のミスです。 仰る通りです。 色々な要因で効率が下がる可能性はあるのですが、あまりにも効率が低すぎて困っております。一回で1000取れれば試行回数を増やせば済むのですが、100ですと回数で補うにしてもコストが高くなってしまいます。 3回行ったのですがいずれも100以下になっています。 手法を改善させて少しずつ効率を上げて行きたいと考えています。 質問させていただいた後にも色々と調べて見ました。 仰る通りDNAを精製しなおしたり抽出法を変えることで改善されることがあるようです。 ホストも変えてみたいと考えていました。 DH5 alphaは知りませんでした。是非使ってみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.3446-5 - 2010/11/02 (火) 20:52:42 - Actias >１つの株ではできていますし、コンカテマーが作れていることまでは確認しているので、実験操作のミスではないと考えています。 に、反論するとすれば、 クローニングできない遺伝子あるいは領域はあると思います。 宿主にしてみれば、部分異数体にさせられたようなものですから。 しかし、20000取れるものが100、乱暴に計算するとゲノムの99.5% がそういう領域？ それは考えにくい。 よって、手技のミスです。 で、手技のミスを主張したいわけではなく、手技のミスである 可能性も考えたほうがいいですよ、といいたいだけです。 片方はできているので、何か違いがあるのですよね。 DNA 抽出方法を変えると、何とかなるのでしょうか。 マウスでBACを作るときは、組織をそのままアガロースゲルに埋めて、 電気的に組織からDNA を抽出させるのではなかったでしょうか？ バクテリアにそれが通じるかどうか分かりませんが。 コスミドライブラリーは作ったことがありませんが、アデノウイルス ゲノムが丸ごと入ったコスミドは、扱っています。 ホストはDH5 alpha なので、ホストを変えてみては？

(無題) 削除/引用 No.3446-4 - 2010/11/01 (月) 14:36:35 - コンタミ太郎 おお様 　私と同じ系でいくつかコスミドライブラリーを作っているのですが、 だいたい20000くらいです。イラストレイテッドのファージベクターとかと比べるとかなり 少ない気がしますが、私の系だとこれぐらいの効率になってしまいます。 　Streptomycesのゲノムは7 Mb程度なので、1000コロニーを コロニーハイブリダイゼーションすれば5個くらい取れてきます。

(無題) 削除/引用 No.3446-3 - 2010/10/31 (日) 03:22:42 - おお >ライブラリー作製ができた方では一つのライブラリーで20000程度の >形質転換体が得られましたが、できない方では100以下しか得られません。 これじゃあ両方とも系がうまくいってないと見た方がいいようなきがします。 20000程度で十分なんでしょうか？

補足説明 削除/引用 No.3446-2 - 2010/10/30 (土) 23:18:53 - コンタミ太郎 すみません。少し捕捉させていただきます。 ライブラリー作製ができた方では一つのライブラリーで20000程度の 形質転換体が得られましたが、できない方では100以下しか得られません。

コスミドライブラリー作成のトラブルシューティング 削除/引用 No.3446-1 - 2010/10/30 (土) 22:53:31 - コンタミ太郎 お世話になっております。 私は細菌を研究対象としている大学院生です。 現在、自身でスクリーニングしてきた放線菌Streptomyces、2株について ゲノムライブラリーをコスミドを用いて作成しようとしています。 1つの株は無事にライブラリーを作ることができたのですが、 もう１つのライブラリーが作れなくて困っています。 packaging kitはストラタジーンのgigapack III XLを、 感染させる大腸菌はXL1 Blue MR株を用いています。 １つの株ではできていますし、コンカテマーが作れていることまでは確認しているので、実験操作のミスではないと考えています。 ゲノムのメチル化修飾がこういったpackaging反応や大腸菌内での複製を 阻害することがあるらしいのですが、こういった場合、次にどういった ことを検討するべきでしょうか。 コスミドライブラリーを作成できない菌もいるのでしょうか。

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