BioTechnicalフォーラム [”効く！”shRNA配列]

”効く！”shRNA配列

No.3444-TOPIC - 2010/10/30 (土) 11:59:39 - PEN

皆様、shRNAを自作される時どこの配列（アルゴリズム）を使われてますか？

うちではOligoEngineとかOpenBioとかの配列で作ってるのですが、25％くらいしか実際にエンドのタンパクを抑制しません。
ちなみにベクターはpSuperです。
せめて半分くらいは使えるやつになってほしいのですが。。。
ここの配列は良いよ！というのをご存じの方いらっしゃったらご教授ください！
　

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なるほど！

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No.3444-13 - 2010/11/01 (月) 20:50:58 - PEN

＞「この『使えるやつ』は何％くらい抑制したのか？」ということをお聞きになりたいのではないかと思いますが…。

なるほど！
完全に勘違いしてました。
言葉足らずですみません。
私の記述の25%程度というのは、４つ作っても1つ位しかちゃんと抑制のかかるものがないという意味です。

使えるやつというのは、特に基準はありませんが50%くらいは抑制されてほしいところです。
上のやつは90%は抑制されてまして、「使えなかった」というのは全く抑制がかかっていないという意味です。

＞pSUPERに入れてました。最近はもっぱらシグマのやつを買っているので、記憶が定かではないのですが、Target配列として出てくる23ntから両脇のoverhanngの部分2ntを除いた19ntを組み込んでいたと思います。
間違っていたらすみません。

それでやってみます。
シグマから買えれば良いんですがねぇ。金銭的に厳しいので。。。
ありがとうございました！

(無題)

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No.3444-12 - 2010/11/01 (月) 19:10:14 - MP

> siDirectの配列はどのVectorに入れられてますか？
> pSuperの場合、プロトコール的には19塩基を入れるとか、overhangを入れるようになってないなど、siDirectのままの配列を入れてしまって良いものか悩んでいるのですが。
> ご教授ください。

pSUPERに入れてました。最近はもっぱらシグマのやつを買っているので、記憶が定かではないのですが、Target配列として出てくる23ntから両脇のoverhanngの部分2ntを除いた19ntを組み込んでいたと思います。
間違っていたらすみません。

(無題)

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No.3444-11 - 2010/11/01 (月) 17:08:00 - mom-a

＞＞＞最初２つ作って、ひとつ使えるやつができました。
＞
＞＞これで何％？
＞
＞この時点で50%と仰りたいのでしょうか？

「この『使えるやつ』は何％くらい抑制したのか？」ということをお聞きになりたいのではないかと思いますが…。

私は25％というのは抑制率のことを言っているのだと思っていたのですが、「使えるやつが取れた確率」のことだったのでしょうか？だとすると、どの程度抑制されているもののことを「使えるやつ」と考えているかによっても、対処法が違ってくるのではないでしょうか。

siDirect

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No.3444-10 - 2010/11/01 (月) 15:11:06 - PEN

＞ポスドクTさん、MPさん

siDirectの配列はどのVectorに入れられてますか？
pSuperの場合、プロトコール的には19塩基を入れるとか、overhangを入れるようになってないなど、siDirectのままの配列を入れてしまって良いものか悩んでいるのですが。
ご教授ください。

＞これで何％？

この時点で50%と仰りたいのでしょうか？
ひとつのターゲットに対して２種類の配列を用いるのがKDの王道だと思うので、２つ目を作ろうとして合計４つ作成した中で１つしか使えるものがなかったため25％と書きました。
関連する他の標的に対しても作ってきましたが、全体的にこれくらいの成功率のような印象を受けてます。

やはり標的ごとにKDの難しさに差があるのでしょうか。
余談になりますが、先ほどsiDirectで配列を調べたところ、現時点で成功している配列は含まれていませんでした。

(無題)

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No.3444-9 - 2010/11/01 (月) 14:33:46 - おお

>最初２つ作って、ひとつ使えるやつができました。

これで何％？

ありがとうございます

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No.3444-8 - 2010/11/01 (月) 13:48:42 - PEN

皆様情報ありがとうございます

siDirect試してみます。

SigmaやらOpenBioやらで配列公開されてますけど、比較するとあんまり同じ配列部を標的にしてることがないという印象です。
結局アルゴリズムによって全然違うってことなんでしょうね。

＞以前もたしか話題になったのですが、Sigmaで売られているshRNAは配列が公表されているので、それを参考にするのもありかとは思うのですが、やはりこれって禁じ手なのでしょうか？

個人的には全く問題ないという認識なんですが。
商用ではないですし、そもそも実際作ってみないと、使えるかどうかは分らないですし。

＞トランスフェクションとか他の部分は改善する余地がないんでしょうか、、、
どんなものをつかっても２５％というのはちょっと、、、

ポジコンがあるやつもなかなかなんですよね。
最初２つ作って、ひとつ使えるやつができました。
で、２つ追加で作っても両方使えない、といった感じです。
この時最初の使えるやつをポジコンに使ってるので、トランスフェクションは問題ないと考えています。

＞記述からすると、25%抑制ってのはタンパクレベルですね？
mRNAレベルでは？
もしmRNAがちゃんとKDされているなら蛋白の方は別の問題かと。

mRNAでは見てないですが、ターンオーバーとかの問題ですよね。
たぶん上に書いたことで、その可能性は排除できると思うのですが。。。。どうでしょう？

(無題)

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No.3444-7 - 2010/10/31 (日) 09:48:26 - MP

言い忘れましたが、pSuperのH1 promoterの場合でも、ターゲット配列の最初はGの方が効きがいいような印象です。

(無題)

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No.3444-6 - 2010/10/31 (日) 03:36:09 - PPGPT

記述からすると、25%抑制ってのはタンパクレベルですね？
mRNAレベルでは？

もしmRNAがちゃんとKDされているなら蛋白の方は別の問題かと。

(無題)

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No.3444-5 - 2010/10/31 (日) 03:26:24 - おお

トランスフェクションとか他の部分は改善する余地がないんでしょうか、、、
どんなものをつかっても２５％というのはちょっと、、、