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補足 削除/引用 No.3441-7 - 2010/10/31 (日) 13:44:12 - 鳥茶 >FACS にかけた後の細胞は光ってるの？、どこの工程まで光っていたか。 >細胞集団全体を解析しても検出出来なかったのでしょうか？ 細胞をばらすまでは蛍光を確認できていますが、単一細胞に処理する過程で、光っている細胞がいるかどうかは確認していません。また、ゲートをかけずに解析を行ってもGFP陽性細胞は全く検出できず、蛍光顕微鏡でGFP蛍光を確認できませんでした。ただし、蛍光が弱く、単一細胞レベルで発現を確認できない可能性はあります。 >FACSのセッティングか機械自体の問題 機械やその設定に関してですが、同一の親株にEGFP遺伝子をノックインした株(仮にB株とする)の設定を基にソーティングを行いましたので、機器の不具合である可能性は低いのかなと考えています。 皆さんから頂いたご意見を基に 次回作業時に、どこまで細胞が光っているのか？とB株でのソーティングも同時に行うことで可能性を検討することにします。 また、RT-PCRやウエスタンでFP発現を確認しようと思います。 他の可能性があるようでしたら、コメントを頂けると助かります。 よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.3441-6 - 2010/10/30 (土) 17:12:08 - Actias No.3441-5 の訂正、というか補足。 スキャンじゃなくてソーティング？

(無題) 削除/引用 No.3441-5 - 2010/10/30 (土) 17:10:38 - Actias 「FACS にかけた後の細胞は光ってるの？」 という、素人質問をします、あえて。 できないなら、どこの工程まで光っていたか。 機械に吸い込まれる直前までは光ってたなら、機械の問題。

(無題) 削除/引用 No.3441-4 - 2010/10/30 (土) 13:16:23 - Boston-Pullman マイナーなコメントですが、GFP陽性細胞がアグリ易く、singlet を解析した際に除かれてしまった可能性。細胞集団全体を解析しても検出出来なかったのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3441-3 - 2010/10/30 (土) 09:57:46 - qq >蛍光顕微鏡下ではGFP蛍光を確認できるのに、 と思っているシグナルが、細胞の自家蛍光や細胞内粒子のノイズだったりする可能性もないわけではないと思います。元株との比較してGFP蛍光があると判断しているのですか？元株ではほぼ無蛍光なのに、EGFP株の細胞では、ほとんど全ての細胞で蛍光を確認できるのでしょうか？ 「赤の波長域にも漏れ込んでいる様子はなく」とのことですから、ノイズではないように思いたいところです。 ウェスタンが可能でしたら、FACSの問題以外を除去できそうに思います。

(無題) 削除/引用 No.3441-2 - 2010/10/30 (土) 04:34:26 - おお FACSのセッティングか機械自体の問題。

GFP蛍光 削除/引用 No.3441-1 - 2010/10/30 (土) 02:12:52 - 鳥茶 細胞(組織)特異的プロモーターにつないだEGFP遺伝子をランダムインテグレーションで導入したES細胞を樹立しましたが、蛍光顕微鏡下ではGFP蛍光を確認できるのに、FACSではGFP陽性細胞を検出できず、全く細胞を分取することができません。また、赤の波長域にも漏れ込んでいる様子はなく、蛍光強度が高すぎて検出できなかった訳でもないようです。 この現象は、どのような理由からなのでしょうか？素人質問で申し訳ないですが、ご教授して頂けると助かります。

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