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(無題) 削除/引用 No.3439-14 - 2010/11/03 (水) 01:24:28 - A >この際ですからとことんincubator内の清掃を行ってみます！ 個人的にこれで解決しそうな気がしますが念のため。 私はsf9株では無くHigh Five株でしたが抗生剤はゲンタマイシンを 使っていました。 >ディスポのピペットだと先が細くなく、Sf9が継代時にそれでは >剥がれないんです。 同僚がsf9株使っているのを見たことがありますがフラスコの底に 張り付いている細胞をスクレイパーでゴシゴシ引っ掻いて剥がして 問題なかったはずです。自分がHigh Five株を扱っていた時も 同様の操作です。その様にラフ（？）に扱えるのが昆虫細胞の 利点の一つのはずですがそうするわけにはいかない訳でもあるの ですか？ あとできる環境にあるのかわかりませんが清掃後も同じ様にコンタミ が起こるのであれば他の研究室なり知り合い（例えばストックを 分けてもらったと書いていた）のコンタミのないことがわかっている incubatorを借りて継代してみては？同時にその辺りに詳しい人に 事情を話して時間をとってもらって自分の操作を見てもらうのも 良いかと思います。 もう解決しているようでしたら無視してもらってかまいません。

(無題) 削除/引用 No.3439-13 - 2010/11/01 (月) 15:54:12 - DSC Sf9を使い始めたときからずっと、常にpenicillin-streptmycinは加えて培養しています。 SigmaのP0781をSf900IIに1/100 v.加えているので、final 100 U penicillin + 100 ug streptmycin/mL mediumです。 メーカーから購入したストックを起こしたときからずっと加えています。 これまで問題があった（気にした）ことはありません。 なしだったものに途中から添加するのならば、馴化が必要かもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.3439-10 - 2010/10/30 (土) 00:29:02 - おお >どれほど自分の操作は酷いんだ あ、いや醜いとまでいいませんが、なにか気がつかない ところでこんたみするようなことをやってしまっている かもしれません。 毎回同じ菌だとすると、多分そーすはいっしょですね。 だとすると、おなじところからきているといっても いいかもしれません。 >乾熱滅菌済みものひと缶をラボメン共用で使用しています ほかのひとはそれをつかってこんたみしてますか？

(無題) 削除/引用 No.3439-9 - 2010/10/29 (金) 20:49:41 - sin 培地だけインキュベータに入れてもコンタミ起きますかね・・

とりあえず一番疑わしい原因 削除/引用 No.3439-8 - 2010/10/29 (金) 20:41:49 - ami コンタミを繰り返すのは、細胞自身がストックのもすでにコンタミしている、というのが一番疑わしいような･･･もらえるところがあればもらってみるというのが僕だったら一番にやってみる気がする。

(無題) 削除/引用 No.3439-7 - 2010/10/29 (金) 20:21:21 - コンタミ恐怖症 >まず、こんたみのそーすが気になりますね。 そんなにこんたみするには、何か原因がありそうです。 というのも、普通そうしょっちゅう起こるものでも ありませんから（たとえ抗生物質抜きでも）。 ありがとうございます。 'たとえ抗生物質抜きでも' この一言で救われました。 これほど厳重にコンタミ対策を講じているのに、どれほど自分の操作は酷いんだ…と沈んでいましたので。 この際ですからとことんincubator内の清掃を行ってみます！ありがとうございました皆様！！

(無題) 削除/引用 No.3439-6 - 2010/10/29 (金) 20:19:04 - コンタミ恐怖症 >おそらく既にラボにタンパク質発現sf9株がありますよね。 その株を使って、PSの濃度を振って培養し、細胞増殖、タンパク質のタイターと質に与える影響を見てみるのが早いし、上司も納得させられるのではないでしょうか。 PSに"sensitive"な細胞株で、菌が殖えなくなる前に細胞が殖えなくなるのであれば使う意味はありませんが、貴方のﾗﾎﾞのsf9が特殊でない限りは、文献情報と同じ結果が期待できるでしょう。 コメントありがとうございます。 一度P/Sの濃度検討を行ってみますね。 >ただ、抗生物質はコンタミした異物の増殖を押さえるものであって、コンタミ自体を押さえるものではありません。 安全キャビネットやインキュベーター等のメンテナンスや、操作スキルの修得などで抗生物質無しでもコンタミしないようにするほうが正攻法だと思いますけど。 昔、インキュベーターのファンがカビだらけで、そのインキュベーターに細胞を入れるとコンタミするというトラブルが生じたことがあります。 ですよね〜。 ほんとしょっちゅうというか、毎回糸状菌様のものが生えます。 Sf9を疑って別のlabから分譲していただいても、コンタミしました。 手袋頑丈に装備し、腕までアルコール消毒。 かなり頻繁にアルコール消毒もし、ベンチも厳重にアルコール消毒してます。 Sf9は10 cm dishで飼っていますが、ベンチ内でそのフタを開ける際にはバーナーの近くで行っていますし、ガラスパイペットも洗浄後、乾熱滅菌済みものひと缶をラボメン共用で使用しています。 ディスポのピペットだと先が細くなく、Sf9が継代時にそれでは剥がれないんです。 先の細いガラスピペットで勢いよくdishに振りかけないと。。 リサイクルピペットも原因かなあ。。 でもディスポのピペットでも十分Sf9が剥がれてくれるのなんてありますかねえ？ 引き続きアドバイスいただけますとありがたいです。お願いします。

(無題) 削除/引用 No.3439-5 - 2010/10/29 (金) 15:42:03 - おお まず、こんたみのそーすが気になりますね。 そんなにこんたみするには、何か原因がありそうです。 というのも、普通そうしょっちゅう起こるものでも ありませんから（たとえ抗生物質抜きでも）。 ラボですとっくしている物がすでにコンタミしているとか、 よほどインキュベーターなどに菌が蔓延しているとか、、 抗生物質よりそちらの方をなんとかしないと、 結局はこんたみしちゃいますよ。 ｓｆ９、文献ではｐｓいれているものよくみかけますね。。。 かなマイシンでもいいんかなぁ。 いっそうのこと抗生物質のまーかー遺伝子でもほり込んで、 その抗生物質存在かでかうとか、、、まさかねぇ。 カビ系のコンタみなら、ファンギゾンとかいくらかおさえれる ものもありますけど（コンタミ除去ようで）、細胞自身へのダメーじや影響はかなり あるかもしれないとおもってください。

(無題) 削除/引用 No.3439-4 - 2010/10/29 (金) 14:51:33 - ~ おそらく既にラボにタンパク質発現sf9株がありますよね。 その株を使って、PSの濃度を振って培養し、細胞増殖、タンパク質のタイターと質に与える影響を見てみるのが早いし、上司も納得させられるのではないでしょうか。 PSに"sensitive"な細胞株で、菌が殖えなくなる前に細胞が殖えなくなるのであれば使う意味はありませんが、貴方のﾗﾎﾞのsf9が特殊でない限りは、文献情報と同じ結果が期待できるでしょう。 >本当に加えてもよいのかどうか 加えていいかの判断基準は、貴方か上司が決めるものですよね。 求める量・質のタンパク質が得られるのであれば、後は上がるコストを受け入れられるかが判断基準になるでしょう。 ただ、抗生物質はコンタミした異物の増殖を押さえるものであって、コンタミ自体を押さえるものではありません。 安全キャビネットやインキュベーター等のメンテナンスや、操作スキルの修得などで抗生物質無しでもコンタミしないようにするほうが正攻法だと思いますけど。 昔、インキュベーターのファンがカビだらけで、そのインキュベーターに細胞を入れるとコンタミするというトラブルが生じたことがあります。

(無題) 削除/引用 No.3439-3 - 2010/10/29 (金) 14:21:07 - コンタミ恐怖症 ありがとうございます。 カビですもん死ぬわきゃないですよね…ははは すみません。 糸状菌と同定されたわけではないので、断言はできないのですが。。 もしカビだとすれば普段私が飼ってるがん細胞や線維が細胞などもたとえDMEMとかにP/Sが入っていても糸状菌だとすればincubatorが違えど感染しうると思うんですが、そう考えるとincubator自体の除染をしっかりやった方がbetterなんでしょうかねえとパンプキンさんのコメントみて思いました。 引き続き、みなさまからのアドバイスをお待ちしています。 些細なことで構いません。どうぞ宜しくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.3439-2 - 2010/10/29 (金) 14:12:25 - Pumpkin >糸状菌であれば、これら薬剤で死ぬはず。 本当ですか？

Sf9を培養した場合に抗生剤は加えていますか？ 削除/引用 No.3439-1 - 2010/10/29 (金) 14:05:31 - コンタミ恐怖症 みなさまお助けください。 現在、Sf9昆虫細胞を利用してタンパク質発現を行っているものです。 が、糸状菌による培地のコンタミネーションが激しく困っております。 培地は、GIBCO製のSf-900 II SFMを購入し、特にそれに何も添加することなく使用しています。 この培地にはdefaultでは抗生物質は入ってはおりません。 また、私もSf9は非常にsensitiveな細胞であるため、抗生剤など入れるべきではないと上司から教わり、今日に至っております。 しかし、あまりのコンタミの頻度の酷さに頭を抱え、論文を色々調べてみました。 すると、All media were supplemented with 50 U/ml penicillin and 50 μg/ml streptomycin. と書かれてあるではありませんか！ 糸状菌であれば、これら薬剤で死ぬはず。 ならばとこれら抗生剤を購入したSf-900 IIに加えてみればよいではありませんか！ …と単純に考えました。 しかし上司の'sensitive'という言葉が気がかりで、本当に加えてもよいのかどうか、疑問に思いましたので、みなさまにお聞きしました。 どうか、みなさまのアドバイスをいただけますと幸甚です。 incubatorもアルコールで消毒などしてるのですが、いっこうにおさまる気配すら感じられません。お助けください、宜しくお願いします。

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