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(無題) 削除/引用 No.3437-5 - 2010/10/28 (木) 19:40:02 - AP Oligo-dTでプライミングすると、プライミングする位置にバリエーションができます。PCRプライマーに使うと、毎サイクル違った位置からプライミングされ（slippage)、もとより短くなるだけでなく長くなるものもでてきたりして、原理的にスメアになります。 それを防ぐには、Oligo-dTプライマーの3'末端の1塩基か2塩基をdegenerateするという方法があります(1塩基の場合はT以外で、2塩基の場合は、末端から二番目をT以外、一番目を4種の塩基で）。これで、3'UTRとpoly A tailの継ぎ目からのみプライミングされます。 PCRのときにもこのdegenerate oligo-dTをプライマーにするというのもひとつの手です。しかし、どうせなら、適当なプライマーアニーリング配列oligo-dTの5'側にをつけておくとか、アダプターとしてligationでくっつけるとかして、その配列に対応するプライマーでPCRをかけるほうがスマートでしょう。 KitとしてはClontechのMarathonが洗練されています。Kitを買わないにしても、説明書に目を通すだけでヒントになるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.3437-4 - 2010/10/28 (木) 19:24:41 - ザンギ 3'-RACE PCRをnestedにして１kbくらいの断片ならとったことがあります。 長いのは増えにくいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3437-3 - 2010/10/28 (木) 19:13:55 - Oligo+dT Pumpkin様 > ひとつ確認ですが、matureになる部分だけの配列が欲しいというのはそこの部分のORFが手に入ればいいということですか？ おっしゃる通りです。 > だとすればoligodTしゃなくて、gene specific primerで増やした方がいいのでは？3'UTRが欲しいとか、poly A 付加サイトを知りたいということですか？ ヒト配列のORFの最後の部分を基にgene specific primerを設計してPCR した場合、そのprimer部位の正しい配列は得られません。matureになる 部分の正確な配列が知りたいためその下流の配列を使ってクローニング がしたいということです。3'UTRから設計することも考えているのですが その部分は発現されない部分ですから種間の相同性がORFよりも低いのでは ないかと想像されるため（残念ながら他の霊長類でわかっているのはORF まで）、reverseにOligo dT使いたいということです。

(無題) 削除/引用 No.3437-2 - 2010/10/28 (木) 18:58:41 - Pumpkin ひとつ確認ですが、matureになる部分だけの配列が欲しいというのはそこの部分のORFが手に入ればいいということですか？ だとすればoligodTしゃなくて、gene specific primerで増やした方がいいのでは？3'UTRが欲しいとか、poly A 付加サイトを知りたいということですか？

OligodTを使ったPCRによる遺伝子クローニング 削除/引用 No.3437-1 - 2010/10/28 (木) 18:26:08 - Oligo dT いつもいろいろと参考にさせて頂いています。 現在ある霊長類のcDNAライブラリーからヒトの既知遺伝子の ホモログのクローニングを試みています。既に幾つかの他の 霊長類で同じ遺伝子がクローニングされており、どの霊長類も ヒトと相同性がかなり高いことがわかっています。この遺伝子は プロ型蛋白質として発現されその後プロペプチドの切断を受けて 活性型になるのですが、私は活性型の全長がクローニングできれば 問題ないのでForwardプライマーはヒトの配列(プロペプチド部位 より設計Tm約51度)、ReverseプライマーにはInvitorgenから発売 されているOligo(dT)20(cat.18418-020)を使ってPCRにより ライブラリーから得ようと試みています。ご存知の通りOligo dTは Tm値が低いと予想されるので現在はアニーリングを50度に設定して PCRしているのですが出てくるのはスメアになったPCR産物ばかりで 特異的なバンドが全く見られません。これと平行してヒトの配列を 基に設計したプライマーで部分的な配列が得られているのでライブ ラリー中に目的の遺伝子が存在するのは確かなようです。どなたか 同じようにOligo dTを使ったPCRで遺伝子クローニングを行った経験を お持ちの方、またそうでない方でも何らかのアドバイスがありましたら レス頂けないでしょうか。宜しくお願い致します。 現在他の実験と平行に行っているため直ぐにはできないのですが 来週半ばを目安に次回は温度の範囲を50-53度ぐらいにふったPCR を行って見ようと思っています。

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