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(無題) 削除/引用 No.3437-25 - 2010/11/03 (水) 03:22:43 - おお >目的遺伝子のコード部位ではチンパンジーやヒトを含む他の霊長類間で >95%ぐらいの相同性があったと記憶しています。 ゲノムワイドでみるとオーバーオール(イントロンも含め)95%という数字だと思ってましたが。。。

(無題) 削除/引用 No.3437-24 - 2010/11/03 (水) 01:06:42 - おお 最近牛のゲノム情報が充実してきてますが、マウスよりは 人によく似ていますね。そのあたりもし興味があれば。。。

(無題) 削除/引用 No.3437-23 - 2010/11/03 (水) 00:19:15 - Oligo dT ザンギ様 > 他の生物種の遺伝子の探し方はどうされましたか？ > 霊長類とイヌにしか見つからないっていうのはちょっと不思議な感じです。 この遺伝子は霊長類では幾つか報告があるのですがそれ以外にたまたま イヌのホモログのmRNAの配列が報告されているために知っているという ことです。他の哺乳類にホモログが存在しているのかいないのかはまだ はっきりしておらず、少なくとも今のところ知られていないということ です。ただマウスゲノムについてはヒトゲノムとの比較が既に行われて いてこの遺伝子の存在していると予想されているマウス上の遺伝子座上 に存在していません。実はこの遺伝子には他にファミリー分子が存在 するのですがそちらはヒトの遺伝子から予想された遺伝子座上に存在 しているため、私が目的としている遺伝子はマウスには存在しないの だろうと考えられています。もちろんこの遺伝子が何処かに転座して いる可能性を完全には否定できませんが。 > 試しにヒトのCDH1のmRNAをqueryにして、NCBI genomesに対して検索して > みました。霊長類以外にもウシやらウマやらイヌやらラットやら出てき > ましたが、なんとマウスは見つかりません（笑） > この例は最もプリミティブな検索の仕方なのでゲノムからは見つけられ > なかったのですが、経験からすると意外とこんなレベルのものもデータ > ベースの中には混じってるのかもしれませんよ。 > 整理されてないデータベースの解析に取り組むよりは、実験する方が > 生産的な場合が多いのですが、まぁご参考まで。 ご意見ありがとうございます。試しに目的としている遺伝子のヒトのmRNA 配列を使って同じようにNCBI genomesを検索してみました。幾つかの霊長類 が引っかかってきてそのあとにウマや少数のげっ歯類（マウスを含め）が 続きました。ただ、相同性を見ると霊長類が95-100%の相同性であるのに 比べ他の哺乳類は20%に満たない相同性でした。少なくとも既に報告(mRNA の解析)のあるイヌに関しては何も上がってきていませんからこの検索は 完全ではないと思いますがなにか見つけられる可能性は低そうです。

(無題) 削除/引用 No.3437-22 - 2010/11/02 (火) 21:14:40 - ザンギ 余談ですが、 他の生物種の遺伝子の探し方はどうされましたか？ 霊長類とイヌにしか見つからないっていうのはちょっと不思議な感じです。 試しにヒトのCDH1のmRNAをqueryにして、NCBI genomesに対して検索してみました。 霊長類以外にもウシやらウマやらイヌやらラットやら出てきましたが、なんと マウスは見つかりません（笑） この例は最もプリミティブな検索の仕方なのでゲノムからは見つけられなかっ たのですが、経験からすると意外とこんなレベルのものもデータベースの中には 混じってるのかもしれませんよ。 整理されてないデータベースの解析に取り組むよりは、実験する方が生産的な 場合が多いのですが、まぁご参考まで。

(無題) 削除/引用 No.3437-21 - 2010/11/02 (火) 20:05:02 - Oligo dT ザンギ様 >すいません、ちょっと離れてる間に　おおさんとAPさんのフォローを >沢山もらってますね。 すいませんなんていわないでください。この掲示板はあくまでボランティア でザンギさんがフォローされるかどうかお決めになることですから。 >気分を害するようなことは全くないのですが、ちょっとずれてるかなと >思ったので。 それならば安心です。こちらの勘違いでそう感じてしまったもので。 >CDSの正しい配列を確定しておいて、１００％マッチのプライマーを >設計して改めてPCRクローニングするのが効率的と思います。 >それからダイレクトシーケンスはちゃんとやればかなりの部分をちゃんと >読めますよ。コツはプライマーをちゃんと除去することと、鋳型の量を >加減することでしょうか。つい多すぎる量を使いがちです。 何度かゲルやカラム精製したPCR産物をダイレクトシークエンスに使った ことがあるのですが基本的にきれいに読めている部分であっても１塩基だけ 二重ピークが出てきたりしたことが多かったもので。今のラボはシーク エンスは全て外注なので鋳型の量は業者任せでやっています。追加料金無し で1-2回読んでくれるので次回うまく読めたかった時には鋳型の量について 業者に相談してみます。 > UTRはゲノムにコードされてるんですが、どう転写されてるかはcDNAを >ちゃんと読まないとわからないので情報を得にくいですね。 > ゲノム配列の終止コドンの直後くらいは同じExonに入ってるかもしれ >ないので、他の生物種とゲノム配列を並べてみても損はないかと思います。 > 保存されてそうならそのサイトでプライマーを設計してみてもいいかと。 先ほどのおおさんへのレスや以前にも書いたのですが霊長類でわかって いるのは基本的にコード部位のみでUTRまでわかっているのはヒトのみの ようです。またこの遺伝子はマウスには存在しないようで霊長類以外で 確認されているのはイヌだけだったと記憶しています。ですから比べると したらヒトとイヌぐらいですか。イヌのコード部位は間違いなくわかって いますがUTRを含む全長mRNAが解析済みだったかははっきり覚えていません。 調べてみないとわかりませんがヒトとイヌまで行くと多分かなり違ってますよね。

(無題) 削除/引用 No.3437-20 - 2010/11/02 (火) 18:53:06 - Oligo dT おお様 > 配列を決めると申し上げています。そのフラグメントをつなげるとは > もうしあげていないのですが、、、 すいません。私の勘違いですね。最悪フラグメントを繋げて全長をつくる こともあるかなあと勝手に思っていたもので。 > 霊長類でゲノムを比較したとき大体どれくらい似ているか > ちょっとわかりませんが、チンパンじーでひとと９５％ > 配列が一致していると言われますので、 目的遺伝子のコード部位ではチンパンジーやヒトを含む他の霊長類間で 95%ぐらいの相同性があったと記憶しています。 > ３‘UTRでも > かなり一致しているのではないかと言う希望がありますので、 > 何箇所かチョイスしてPCRしてみればかかるかもしれない > という気もします。 私もそれを考えていわゆる直上の上司と話し合ったのですがある程度の 確信が持てないうちは闇雲にその方法は使わないということになりました。 > たの霊長類では３'UTRの解析がないといいますが、ゲノムの > 配列もそのあたりは読まれていないんでしょうか？ 自分で調べた範囲ではまだ目的遺伝子を含む部位のゲノムはヒト以外 解析されていない、少なくとも公開されていないようで３'UTRに関する 情報はヒトしかみつかりません。

(無題) 削除/引用 No.3437-19 - 2010/11/02 (火) 00:32:30 - ザンギ すいません、ちょっと離れてる間に　おおさんとAPさんのフォローを沢山もらって ますね。 気分を害するようなことは全くないのですが、ちょっとずれてるかなと思ったので。 CDSの正しい配列を確定しておいて、１００％マッチのプライマーを設計して 改めてPCRクローニングするのが効率的と思います。 それからダイレクトシーケンスはちゃんとやればかなりの部分をちゃんと読め」 ますよ。コツはプライマーをちゃんと除去することと、鋳型の量を加減するこ とでしょうか。つい多すぎる量を使いがちです。 UTRはゲノムにコードされてるんですが、どう転写されてるかはcDNAをちゃんと 読まないとわからないので情報を得にくいですね。 ゲノム配列の終止コドンの直後くらいは同じExonに入ってるかもしれないので、 他の生物種とゲノム配列を並べてみても損はないかと思います。 保存されてそうならそのサイトでプライマーを設計してみてもいいかと。

(無題) 削除/引用 No.3437-18 - 2010/11/01 (月) 23:30:12 - おお >>まずはいろいろな箇所をPCRして配列をきめたらどうでしょうか。 >これもひとつの方法だと思っています。ただその場合あとで各部位 >を繋いで全長をつくらなければならないこととORFの一番最後の >部分の配列を直接得られないのでOligo dTでPCRなんとか増幅でき >ないものかと思っています。 配列を決めると申し上げています。そのフラグメントをつなげるとは もうしあげていないのですが、、、 霊長類でゲノムを比較したとき大体どれくらい似ているか ちょっとわかりませんが、チンパンじーでひとと９５％ 配列が一致していると言われますので、３‘UTRでも かなり一致しているのではないかと言う希望がありますので、 何箇所かチョイスしてPCRしてみればかかるかもしれない という気もします。 たの霊長類では３'UTRの解析がないといいますが、ゲノムの 配列もそのあたりは読まれていないんでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3437-17 - 2010/11/01 (月) 22:25:50 - Oligo+dT AP様 > さらに老婆心ですが、 > >PCRのときにもこのdegenerate oligo-dTをプライマーにするというのもひとつの手です。 > この場合、校正活性のないストレートなTaqを使うべきです。プライマー>3'のdegenerateした塩基が削られてしまうと意味がないですから。 > 校正活性のある酵素つかうなら、この方法で得られた配列から遺伝子 >特異的プライマーを設計してから、 全然老婆心ではありません。DNAワークの経験があまり無いのでその辺りに 気が行ってませんでしたから指摘頂いて助かります。

(無題) 削除/引用 No.3437-16 - 2010/11/01 (月) 22:14:21 - AP さらに老婆心ですが、 >PCRのときにもこのdegenerate oligo-dTをプライマーにするというのもひとつの手です。 この場合、校正活性のないストレートなTaqを使うべきです。プライマー3'のdegenerateした塩基が削られてしまうと意味がないですから。 校正活性のある酵素つかうなら、この方法で得られた配列から遺伝子特異的プライマーを設計してから、

(無題) 削除/引用 No.3437-15 - 2010/11/01 (月) 21:36:26 - Oligo dT AP様 > mutationのない本来の配列を知るためには、RT-PCR産物やgenome DNAの >PCR産物をダイレクトシークエンスするのも手です。各塩基ごとに置換を >起こしている分子は少数派なので、多数派である塩基置換していない配列 >が読めてくるはずです。 それは考えたこと無かったですね。全長の５’と３’の末端の部分はダイ レクトシークエンスではうまく読めないでしょうが真ん中の部分について は使えそうです。検討してみます。 > 最近はアダプターをくっつけるとか、もっと洗練された方法が好まれま すが、 > PCRのときにもこのdegenerate oligo-dTをプライマーにするというのも > ひとつの手です。 > この手はクラシックですが、初期のESTプロジェクトでも使われていた > もので（たとえば線虫）、意図されている実験にあうかもしれません。 既におおさんへのレスで書きましたが、まずはこの方法で進めてみようと 思います。先ほどプライマーを注文したところです。

(無題) 削除/引用 No.3437-14 - 2010/11/01 (月) 21:23:20 - Oligo dT おお様 >まずはいろいろな箇所をPCRして配列をきめたらどうでしょうか。 これもひとつの方法だと思っています。ただその場合あとで各部位 を繋いで全長をつくらなければならないこととORFの一番最後の 部分の配列を直接得られないのでOligo dTでPCRなんとか増幅でき ないものかと思っています。 >あと霊長類や近縁の動物のゲノムの情報も徐々に充実してきてますので >そういうので保存されている３‘UTR領域ををさがしてプライマーを >設計するとか。配列がきまれば必要な箇所のPCRはやりやすくなります。 既知の他の霊長類のｍRNAの全長がわかっていると助かったのですが既に 書き込んだようにORFしか解析されていません。今までにわかっている 情報では少なくともマウスでは存在しないようです。ですからかなり 難しいかなあという印象です。まずはAPさんに教えていただいたオリゴ dTを使ってPCRしてみるつもりです。 >ｎ末削るのはいいですけどメチオニンを忘れずに。 過去に既にその間違いをしたことがあります。またプライマーの設計 でも凡ミスが良くあるので今ではプライマーやコンストラクションの 時には必ず同僚に再確認してもらうようにしています。気をつけます。 >APサンのいわれるようにオリゴdt+N(-T)をつかって、5プライム目的の >配列の上流2種類プライマーを作ってネストすれば可也確率があがるかも。 >長ければいいというもんでもないかもしれませんがおりごdTの長さを >長めにとっても良いと思いますね。 APさんから情報を頂いてから過去の論文幾つかで確認してみたのですが PCRに使われているdegenerate部位を含むオリゴdTの長さは11か12でそれ よりも長いものは見当たりませんでした。特別な理由があるのかわかり ませんがそれで結果が得られているようなのでまずはそれを試して みようと思っています。本当にできるのかなあと思っているのですが アニーリング温度を42度に設定してPCRしています。

(無題) 削除/引用 No.3437-13 - 2010/10/31 (日) 11:34:07 - おお APサンのいわれるようにオリゴdt+N(-T)をつかって、5プライム目的の配列の上流2種類プライマーを作ってネストすれば可也確率があがるかも。長ければいいというもんでもないかもしれませんがおりごdTの長さを長めにとっても良いと思いますね。 PCRの条件はTmは目安なので、それより可也たかくてもかかったりしますから、 まずはバンドが出なくなるくらいまでアニーリング温度を上げてその温度より 2度ぐらい下をとればポリAの長さに依存したスメアーなバンドがあっても ノンスペは少ないかもしれません。。。どうやって見分けるかが問題ですが、、 配列が分かっていれば制限酵素できってポリA以外のところが理論的に 合う長さに切断されるか見る手はあるかもしれません。 マンマルではポリAはたしか300bくらい合成されると思いますので( その後プロセスされることもありますが)、特異的なPCRがかかっていたなら、 そんなに上から下までスメアーな事はないとおもいます。

(無題) 削除/引用 No.3437-12 - 2010/10/31 (日) 10:31:43 - AP 蛇足ですが、 >もちろんその時は各段階で数個のクローンを確認するつもりです。 mutationのない本来の配列を知るためには、RT-PCR産物やgenome DNAのPCR産物をダイレクトシークエンスするのも手です。各塩基ごとに置換を起こしている分子は少数派なので、多数派である塩基置換していない配列が読めてくるはずです。 最近はアダプターをくっつけるとか、もっと洗練された方法が好まれますが、 >PCRのときにもこのdegenerate oligo-dTをプライマーにするというのもひとつの手です。 この手はクラシックですが、初期のESTプロジェクトでも使われていたもので（たとえば線虫）、意図されている実験にあうかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3437-11 - 2010/10/31 (日) 03:46:56 - おお まずはいろいろな箇所をPCRして配列をきめたらどうでしょうか。 あと霊長類や近縁の動物のゲノムの情報も徐々に充実してきてますので そういうので保存されている３‘UTR領域ををさがしてプライマーを 設計するとか。配列がきまれば必要な箇所のPCRはやりやすくなります。 ｎ末削るのはいいですけどメチオニンを忘れずに。

(無題) 削除/引用 No.3437-10 - 2010/10/30 (土) 22:09:52 - Oligo dT ザンギ様 > 拝見してると当初の遺伝子取得の目的からずれてきてるような気がします。 私の説明が悪く気を悪くなされたのなら謝ります。 目的はヒトで既にわかっている遺伝子のある霊長類のホモログを クローニングしてそのリコンビナント蛋白質を発現・精製しヒト との機能の違いがあるのか確認することです。発現系には活性型 の配列を組み込もうと思っています。既知のヒト及び他の霊長類 のORFを比べてみるとプロペプチドでさほど差が無いのでヒトの プロペプチドから設計したForwardプライマーとOligo dTで活性型の ORFを取り出そうと思ったわけです。蛋白質の機能解析を行う上では 活性型の配列だけではなくORF全長を取り出したほうがいいのでしょうが 残念ながら活性化するプロテアーゼがわかっていないので活性型を 発現に使おうとしているわけです。 > PCRクローニングに関してはPCRエラーの危険が常にありますから、未知配列 > 取得の場合には複数クローンを配列解析する必要がありますが、長い断片だ > と配列解析自体の手間が大きくなってしまいますね。 まずは活性型のORFがわかった時点でそれを基にプライマーを設計して proof reading 活性を持つpolymeraseでPCRして確認するつもりです。 ORFは2kbpぐらいなのでプライマーの部位も確認できるようにオーバー ラップする部分をつくっても3-4回のPCR断片で確認できると思っています。 もちろんその時は各段階で数個のクローンを確認するつもりです。

(無題) 削除/引用 No.3437-9 - 2010/10/29 (金) 11:55:53 - ザンギ 拝見してると当初の遺伝子取得の目的からずれてきてるような気がします。 CDSの3'-のPCRがヒトの配列から設計したPCRでかからなかったから、RACE やっちゃえってことになってますよね。 PCRプライマーの3'-端の１塩基のミスマッチで増えなくなることは普通に あります。この場合は１塩基短いプライマーに変えるだけでPCRがかかる こともあります。 逆にプライマーの5'-端は多少のミスマッチは許容されてしまいますので、 仮にPCRで増えたとしても正しい配列ではない可能性もあります。 PCRクローニングに関してはPCRエラーの危険が常にありますから、未知配列 取得の場合には複数クローンを配列解析する必要がありますが、長い断片だ と配列解析自体の手間が大きくなってしまいますね。 どうするべきだという意見は控えますが、以上は参考にでもなれば。

(無題) 削除/引用 No.3437-8 - 2010/10/29 (金) 00:45:10 - Oligo dT ザンギ様 レスありがとうございます。 > それなら、やろうとしてることは3'-RACEそのものですよ。 > 僕がやったときは5'-の配列は決まっていたので、3'-のプライマーを >RACEのカセット配列を使って両端でnested PCRできるように合成した >ような気がします。 やはりそうですよね。今使っているｃDNAライブラリーは市販品で特に 両端にカセットのようなものはついていません。既に部分的な5'-の配列 がわかっていますからこのライブラリーに自分でカセット配列を繋げ るのに問題ないバッファー組成ならば（問題ないと思いますが）それを 自分で付けて既知の5'-の配列を利用することで3'-の配列が得られそう です。その辺りメーカーに確認してみます。 > それとCDSのPCRには霊長類共通のdegenerated primerを設計しましたか？ > predictedな配列ばかりだとUTRは間違ってるかもしれないので厳しいで > すが、CDSはたぶん大丈夫でしょう。やってなければ検討してみてくだ > さい。 クローニングした遺伝子は最終的に蛋白質発現を行って機能確認を行う 予定です。仰る通りそれでPCRは走ると思うのですが、reverseプライマー に使った部分の配列がはっきりしない可能性があるのでその方法は使わ ないで置こうと思っています。

(無題) 削除/引用 No.3437-7 - 2010/10/28 (木) 22:04:53 - ザンギ それなら、やろうとしてることは3'-RACEそのものですよ。 僕がやったときは5'-の配列は決まっていたので、3'-のプライマーをRACEの カセット配列を使って両端でnested PCRできるように合成したような気がします。 それとCDSのPCRには霊長類共通のdegenerated primerを設計しましたか？ predictedな配列ばかりだとUTRは間違ってるかもしれないので厳しいですが、 CDSはたぶん大丈夫でしょう。やってなければ検討してみてください。

(無題) 削除/引用 No.3437-6 - 2010/10/28 (木) 21:26:05 - Oligo dT 情報を頂きありがとうございます。 ザンギ様 >3'-RACE PCRをnestedにして１kbくらいの断片ならとったことがあります。 >長いのは増えにくいかもしれません。 確かヒトでORFが１kbぐらいで、3'UTRが2kbぐらいです。正直理論が わかっていないのですがどんなreverseプライマーを使われたのですか？ polyTですか？それともspecific primerですか？ AP様 >それを防ぐには、Oligo-dTプライマーの3'末端の1塩基か2塩基をdegenerate >するという方法があります(1塩基の場合はT以外で、2塩基の場合は、末端 >から二番目をT以外、一番目を4種の塩基で）。これで、3'UTRとpoly A >tailの継ぎ目からのみプライミングされます。 正直まだ完全には理論を理解していないのですがそんな方法があるんで すね。ClontechのMarathonのマニュアルをダウンロードしてさっと見た のですがこのキットでも同じ原理を利用しているようです。その辺り リファレンスもありますしもう少し詳しく確認してみます。

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