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(無題) 削除/引用 No.3436-3 - 2010/10/29 (金) 12:19:55 - びぎなー Actiasさんレスありがとうございます。 >2本鎖DNA になっていますか？ 電気泳動によってハイブリダイゼーションは確認しております。 >転写因子は結合できる形になっていますか？ 転写因子のリン酸化しているかということでしょうか？ 核抽出物をWestern Blotを用いて、目的の転写因子のリン酸化は確認しております。 >検出系は？ Streptavidin kitで分離したあと、抽出物をWestern Blotで解析しています。

(無題) 削除/引用 No.3436-2 - 2010/10/28 (木) 21:56:42 - Actias 2本鎖DNA になっていますか？ 転写因子は結合できる形になっていますか？ 検出系は？ 上記それぞれ、なぜそう思うかも含めてご回答を。

オリゴヌクレオチドと目的タンパクの結合について 削除/引用 No.3436-1 - 2010/10/28 (木) 17:55:14 - びぎなー 初めまして オリゴヌクレオチドと目的タンパクの結合について質問があります。 MACSのµMACS Streptavidin kitを用いてオリゴヌクレオチドと転写因子との結合を調べています。 ヌクレオチドの配列はCRE配列、目的の転写因子はCREB、ATF-2、c-Junです。 プロトコルはMACSから提供されている転写因子用のものに則って行っているのですが、うまくいきません。 DNAプローブと目的転写因子との結合に問題があるようなのですが、そのプロトコルでは以下の組成のBinding Bufferを用いて4℃でインキュベートしております。インキュベートの際は静置しています。 Binding B（20mM HEPES-KOH pH7.9、2.5mM MgCl2、100mM KCl、20%Glycerol、0.2mM EDTA、0.5mM DTT、Protease inhibitor） 疑問に思ったのが、インキュベート温度が4℃というのは適切なのでしょうか？ DNAとタンパクの結合であれば4℃より室温やそれ以上の温度の方が適している気がするのですが… また、インキュベートの際はローテーションにかけたほうがいいのでしょうか？ 目的のタンパクによって異なるとは思いますが、Probeとタンパクが結合するには。インキュベートの時間や温度、Bufferの組成などどのようにしたらよいのか、どんなことに注意したらいいのかアドバイスお願いいたします。

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