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(無題) 削除/引用 No.3434-4 - 2010/10/29 (金) 00:39:17 - ccc > �@いつまでG418を培地に入れ続けるものなのでしょうか？普段はペニシリン・ストレプトマイシン入りのDMEMを用いていますが、安定発現細胞の作製が完了したら、もうこれに戻しても良いのでしょうか？ G418を入れ続けたとしても、IRESや自己切断配列などで目的遺伝子をつなげていない限りは、目的遺伝子のみの脱落、silencingは起こりえるので、入れ続ける必要は感じません。脱落しやすい細胞であれば、安定な株をクローニングしたほうが、後々安心して実験に使えます。今までいろいろな細胞に遺伝子を導入しましたが、クローニングした細胞はG418などの薬剤を添加し続けなくても、安定して発現を維持しています。これは安定に発現を維持できる株を拾ってきているからだと思います。どうしても脱落が心配なら、樹立後に大量にストックを作成して、発現が低下したら起こし直せばよいでしょう。 > �Aselection中はペニシリン・ストレプトマイシンを入れなくてもよかったのでしょうか？（入れた方がよいor入れない方がよいorどっちでもよい、どれでしょうか？） いまのところ、抗生物質はselection中でも入れていましたが特に問題はなかったので、「どっちでもよい」、と思います。

(無題) 削除/引用 No.3434-3 - 2010/10/28 (木) 23:55:05 - yyy まあ、あまり神経質になる問題でもないような気はしますが。 G418はアミノグリコシド系でPC/SMとは抗菌スペクトラムが異なるので、G418を入れたからと言ってPC/SMを入れないと言うことはやらない派です。 　 G418は高いし、自分が使ってる細胞の場合は一旦Stableになるとかなり安定してるので、いつまでも入れ続けるということはしない派です。

(無題) 削除/引用 No.3434-2 - 2010/10/28 (木) 21:35:08 - qq 私の方法ですが、 >�@いつまでG418を培地に入れ続けるものなのでしょうか？ クローニング後、一旦、抗生物質を全て除去して、2回程度継代して、コンタミの無いことを確認します。その後は、G418を入れ続けます。入れつづけるG418の濃度は、セレクション濃度の半分が普通ではないのかと思っています。PC+STに戻してはいけません。 1、2ヶ月に一度程度、G418を入れないで継代します。この時に、万が一、コンタミしていたときに、PC+STで叩きます。コンタミしている菌は、G418耐性のはずなので、PCの効果を期待します。 ＞�Aselection中はペニシリン・ストレプトマイシンを入れなくてもよかったのでしょうか？（入れた方がよいor入れない方がよいorどっちでもよい、どれでしょうか？） 入れてはいけません。ストマイは、G418の取り込みを抑制する可能性があります。PCは、デコンタミの切り札に温存しておくべきです。

G418はいつまで入れる？ 削除/引用 No.3434-1 - 2010/10/28 (木) 17:48:18 - PPI いつもお世話になっております。初歩的な質問をご容赦くださいませ。 現在G418/10%FBS/DMEM培地を用いてヒト由来培養細胞で安定発現細胞株の作製を行いました。（最初800μg/mLでselectionをかけ、その後コロニーをひろって100μg/mLで何代か培養しました。） そこで質問が2つあります。 �@いつまでG418を培地に入れ続けるものなのでしょうか？普段はペニシリン・ストレプトマイシン入りのDMEMを用いていますが、安定発現細胞の作製が完了したら、もうこれに戻しても良いのでしょうか？ �Aselection中はペニシリン・ストレプトマイシンを入れなくてもよかったのでしょうか？（入れた方がよいor入れない方がよいorどっちでもよい、どれでしょうか？） アドバイスお願い致します。

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