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(無題) 削除/引用 No.3425-13 - 2010/10/28 (木) 12:37:05 - RNaeeese 調べているうちに、psoralenという薬剤（とその誘導体）が２重鎖RNA（DNAも）をクロスリンクするために使えるらしいことを見つけました。培養細胞に用いるための典型的なプロトコルか参考文献をご存じの方がありましたら教えていただけないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3425-12 - 2010/10/28 (木) 11:25:12 - RNaeeese 皆様、 ありがとうございます。 あべちゃん様、 セミインタクトセルというのは、膜を透過性にした細胞ということですね。それが使えたらRNaseやRNA特異的色素なども使い易くなりますね。透過性処理で問題の応答が失われないかどうか検討してみます。 おお様、 最初からがっぷり正攻法をすべきとのご指摘と思いますが、現状では残念ながら難しいです。それから関与するRNAなのですが、提唱されている構造が緩やかで、そのためもあって多種類あるだろうとのことなのです（というか、ノックダウンが効かないことの言い訳としてそういう説明がなされている）。デコイを目指した実験ではありませんが、一種類のRNAの高発現はほとんど影響ありませんでした。 ~様、 熱はそもそもの反応が阻害されるようです。また、lysateにしてしまうと活性が失われるので、細胞内の何らかの構造に依存しているようです（濃度の問題なのかもしれませんが）。

(無題) 削除/引用 No.3425-11 - 2010/10/28 (木) 02:30:36 - ~ >例えば１時間の間、生化学的な素反応が維持 酵素があまり失活しなければいいのでしょうか？ 二次構造が壊れるくらいの熱をかけたら、酵素も失活するのでだめですよね。 セミインタクトセルよりも雑ですが、低張液で溶血させたり、ソニケーションしたりして、漏れでた細胞質ごとRNase処理だと乱暴すぎますか？ 局在はともかく失活はそこまでしないと思いますが。

(無題) 削除/引用 No.3425-10 - 2010/10/28 (木) 01:40:40 - おお そういう話であれば、らいせーとを使った生化学的なアッセイ系を 樹立するのも平行してやるほうがいいとおもいます。 そういう系ならRNaseなどの添加実験がしやすいと思います。 ２次構造がわかっているということは、代表的な配列はおさえられている わけですよね。それを過剰に細胞にいれてやるとデコイとなって活性が さがるとか。かっせいが上がってもRNAの関与が示唆できると思います。 またその代表的なRNAに化学的修飾して阻害剤として働くようなしすてむ にするとか。よくアルデヒド基をいれて標的タンパクとかにコバレントに つくような阻害剤がありますよね。

(無題) 削除/引用 No.3425-9 - 2010/10/27 (水) 19:47:09 - あべちゃん それなら セミインタクトセルはどうでしょう？

(無題) 削除/引用 No.3425-8 - 2010/10/27 (水) 18:57:39 - RNaeeese 皆様、 いろいろとアイディアをいただきありがとうございます。 AP様、 > 不特定のRNAが取り得る「ある二次構造」でしょうか。 お察しの通りです。それも配列上は制限がかなり緩いようです。 > 全RNAを壊すことができたとしても、たぶん、即死じゃないでしょうか。 何をもって死んでいるとするかにもよるのだと思われますが、例えば１時間の間、生化学的な素反応が維持されていることを期待しています。semi-in vitroのような位置付けのつもりですが、考えが甘いかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3425-7 - 2010/10/27 (水) 17:30:03 - AP >あるRNAの２次構造に依存した機能を失わせたいのですが、 「あるRNA」の二次構造で、そのRNAというのが同定されているならRNAiで壊せるはずですが、そんな簡単なことではないですよね。 不特定のRNAが取り得る「ある二次構造」でしょうか。特定の二次構造をとる共通配列があればRNAiも使えそうですが、そういうのでもない？ 全RNAを壊すことができたとしても、たぶん、即死じゃないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3425-6 - 2010/10/27 (水) 17:13:34 - RNaeeese おお様、 あんまり大雑把な話だというのは私もそう思います。 in vitroでの再構成を目指すような仕事を始めるべきかどうかを決める材料として、そもそもRNAに依存した過程だというのが本当なのかどうかを粗い実験で確かめたいと思いました。現状でも細胞ベースのアッセイだと感度良く活性を見ることが出来るので、乱暴だけどまずはRNAを失活（破壊）するような操作で差が出るのかを見たいと考えました。あまりに乱暴な実験からだとその後のバリデーションは容易ではないと思いますが、ともかく差がでないことには始まらないと考えています。 RNAに比較的特異性の高い色素を使うというのは考えていませんでした。調べてみます。

(無題) 削除/引用 No.3425-5 - 2010/10/27 (水) 16:09:16 - おお RNAていってもねぇ。ほんとに全てのRNAの失活をかんがえているんでしょうか。 マイクロRNAとかは小さいですし、タンパクにかこまれていてなかなかダイレクトには 難しいかもしれませんよ。タンパク合成をとめると、間接的にはtRNA,rRNA,mRNAの 活性をシャットダウンしたようなものですし、、、 あえていうなら、最近シングルストランド核酸に結合する蛍光色素など（検出用として） 出回ってますけどそういうのは細胞のなかで比較的RNAに特異的に結合してくれるかもしれません。 結合により立体障害とかおこれば不活性化できるかもしれません。 問題はどうやってバリデーションするかですねぇ。

(無題) 削除/引用 No.3425-4 - 2010/10/27 (水) 14:55:01 - RNaeeese AP様、 あるRNAの２次構造に依存した機能を失わせたいのですが、どこをどう損なえばその機能が失われるかは分かっていません。無くなってしまえば機能も失われますから、もちろん分解でも構いません。 早い反応を見たいので、RNAの新規合成を止めて量が減るのを待つのは使えないと思っています。 あべちゃん様、 アクチノマイシンDは標的がDNAなんですね。ポリメラーゼを抑えるのかと思っていました。同じようにDNAではなく２重鎖RNAに結合するような薬剤はありませんでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3425-3 - 2010/10/27 (水) 14:07:14 - あべちゃん あくちのまいしんDとかは、駄目ですか？

(無題) 削除/引用 No.3425-2 - 2010/10/27 (水) 14:07:12 - AP RNAを失活とは、どんな活性を失わせたいのでしょう。失活と言うより、分解をもとめているのですか？ II型RNAの活性を失わせるだけなら、薬剤で飜訳阻害してやればいいんだと思いますが、そういう意図ではなさそうですね。

細胞でRNAを失活させる方法 削除/引用 No.3425-1 - 2010/10/27 (水) 13:48:08 - RNaeeese 乱暴な話ですが、培養細胞でRNAをまとめて（というのは配列や長さに依らず）失活させる方法をどなたかご存じではないでしょうか？膜に透過性でRNAに特異的に作用する薬剤があれば理想的なのですが。 今のところ思いついたのは、RNaseをinjection（electroporation？リポソーム？）することと、RNAの吸収が極大になる波長のUVを掛ける（DNAも障害される）ことです。 よろしくお願いします。

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