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(無題) 削除/引用 No.3419-23 - 2010/11/02 (火) 12:12:22 - OPEC 2-MEは今では劇毒物に指定されてるので、取り扱いが面倒です（フェノールもそうですが）。臭いですし。もう少し長持ちするDTTを10mM程度加えておくと、結構長く持った印象があります。もう少し多めに加えるともっともつかな。ただ最近フェノクロはやめたので昔の記憶ですが。

(無題) 削除/引用 No.3419-22 - 2010/11/02 (火) 00:39:11 - ザンギ APさん、レスありがとうございます。 たまたま8HQがなくて作った核抽フェノールが酸化してピンク色になったこと があって、やっぱり入れるほうがいいんだなっておもったことがありました。 メルカプトは入れてましたが、どれくらいの期間効くのかは疑問ですね。

(無題) 削除/引用 No.3419-21 - 2010/10/30 (土) 18:28:59 - AP 実際、Molecular Cloningでは2-MEを入れるようになっています。 私はいれたことないですけれど。

８HQ 削除/引用 No.3419-20 - 2010/10/30 (土) 13:43:54 - 笑い男 　金属イオン類のトラップ効果がある　キレート剤として８HQを 利用しているのかなー　と考えたこともあります。 　金属イオンは２価と３価で酸化還元して・・・・・とかいうのを 防いでいるんじゃね！？ 　本気で酸化防止するならメルカプトエタとかDTTとか、それこそ脂溶性の抗酸化ということでビタミンEとかでもいいのではと思うのですが、あまり使われないですよね（邪魔な成分だからと言われればその通りなんですが）

(無題) 削除/引用 No.3419-19 - 2010/10/29 (金) 19:35:24 - AP ご指名があったのに気がつきませんでした。 決して化学に強いわけではないんですが、、、、 ちょっと調べてみましたが、 キノンは単に酸化剤というだけではなくフリーラジカルの発生源になるらしいです。少しでもキノンが生じるとラジカル連鎖反応で、どんどんフェノールの劣化や核酸等への攻撃が起こると思われます。 なので8HQは単に酸化防止剤というよりラジカルスカベンジャーになっているのではないかと想像します。

(無題) 削除/引用 No.3419-18 - 2010/10/28 (木) 13:33:29 - ぶん DNA抽出後にBisulfite処理するのが目的なら PCRのテンプレートにフェノクロが必要なのかという疑問は あまり意味がないのでは？ Bisulfite処理するのなら、フェノクロ等の精製は必須ですよね？

(無題) 削除/引用 No.3419-17 - 2010/10/28 (木) 07:14:30 - ザンギ ＞ＡＰさん 詳しい解説ありがとうございます。 この頃はすっかり核酸抽出用フェノールの調製をしなくなりましたが、昔やって た頃に抱いた疑問を投げていいでしょうか。 ８ＨＱってちょびっとしか入れないと思うのですが、あの量で酸化防止剤として 働くのに十分なんでしょうか？ ８ＨＱを入れないで調製した核抽フェノールの酸化がはじまると、薄いピンク色 になると思います。経験では、この状態でもDNAには有害でした。 ８ＨＱはフェノールよりも先に酸化されて色が変わると思うので、そういう意味 ではインジケーターと理解していました。 Molecular Cloningよりも旧い原著には書いてあるかも知れませんが、多分50年 くらい前の報文だろうと思い面倒になって調べませんでした。 ＡＰさんはケミストリーに強そうなのでお考えをお聞かせくださいますでしょか。 ＞質問者の方 貴方の日本語と受け答えは少しヘンな気がします。 回答者の中に不愉快に感じておられる方がおられるかも知れません。

(無題) 削除/引用 No.3419-16 - 2010/10/27 (水) 20:44:43 - ソラノ > エタ沈のときも共沈剤は使えないですか？ エタノール沈殿の時には、sodium acetateを加えた後にエタチンメイトを加え、その後100％エタノールを加えています。 酸化したフェノールを使用するとDNAにかなりダメージがあるということがわかったので、新しいものを調製しようと思います。

(無題) 削除/引用 No.3419-15 - 2010/10/27 (水) 17:07:29 - AP >フェノールが酸化してできるキノンは強い酸化力をもち、塩基を酸化します Molecular Cloningを読み返したら、phosphodieater bondの切断（核酸鎖の切断）、核酸同士のクロスリンクを生じるともありました。

(無題) 削除/引用 No.3419-14 - 2010/10/27 (水) 14:22:19 - AP >通常の核酸抽出試薬が黄色いのはインジケーターとして添加してる色素の色です。 キノリノール (8-ハイドロキシキノリン、8HQ)です。酸化防止剤として入れます。黄色く着色して見やすくなるし、酸化が進むとオレンジ〜褐色になるので古くなって使えなくなっているのがわかるという利点もあります。8HQを入れていなくても、酸化してくるとキノン（ベンゾキノン）が生じてくるので褐変します。 フェノールが酸化してできるキノンは強い酸化力をもち、塩基を酸化します。その結果、塩基置換を生じる危険性があります。ちょうどbisulfideでCが酸化されてUになるとかと同じことようなことです。プライマーアニーリングシークエンスに塩基置換が起こったりするとPCRがかからなく場合もあるかもしれません。 今やっている手法にこだわらないなら、スピンカラムベースの少量サンプル用のキット（血球からのDNA抽出用など）のほうがトラブルが起こりにくいと思います。

(無題) 削除/引用 No.3419-13 - 2010/10/27 (水) 13:38:03 - ザンギ 変色したフェノールは酸化してるので、核酸に激しく損傷を与えたような。 PCRもかからない気がする。 本来無色透明だったと思います。 通常の核酸抽出試薬が黄色いのはインジケーターとして添加してる色素の色です。 詳細はMoleculara Cloning等の成書を調べてください。

(無題) 削除/引用 No.3419-12 - 2010/10/27 (水) 09:13:14 - 異伝子 ぶんさん ProKはTE（EDTA）とSDSではなかったですか？ NaClはエタ沈のときでは？ Actiasさん DNAの場合フェノールはTE飽和ではないですか？ ソラノさん フェノール抽出は初めの数回？は上層を回収するのではなく、下層を除去するほうがいいと習いました。あとは個人的にタンパクが多いときはフェノ抽、フェノクロ抽を交互に繰り返しています。 エタ沈のときも共沈剤は使えないですか？ゲノムでやったことはないので詳しくは知りませんが。

(無題) 削除/引用 No.3419-11 - 2010/10/27 (水) 08:21:03 - Actias >また、使用しているフェノールの溶液がかなり褐色になっているのですが、これでは結果にも影響が出てしまうでしょうか？ 茶色になったら捨てている。 いつも、500gを水溶液にし、4分割して、-30℃に保存している。 私の場合ですが。

(無題) 削除/引用 No.3419-10 - 2010/10/27 (水) 00:10:46 - ソラノ > 目的はPCRでバンドが出る事ですか？ 抽出後にBisulfite処理をするため、DNAを濃縮したいというのが目的です。 また、使用しているフェノールの溶液がかなり褐色になっているのですが、これでは結果にも影響が出てしまうでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3419-9 - 2010/10/26 (火) 23:48:30 - ぶん 目的はPCRでバンドが出る事ですか？ フェノクロ前にPCRで濃いバンドが出るのならそれで良いのでは？ フェノクロ・エタ沈を繰り返せばDNAの純度が上がる代わりに 収量が減るのは普通ではないかと思います。 >PCRを阻害 正電荷物質（タンパク等）はDNAに、負電荷物質（糖等）はDNA合成酵素に吸着し、PCRを阻害すると考えられます。

(無題) 削除/引用 No.3419-8 - 2010/10/26 (火) 23:39:06 - G > フェノールクロロホルム抽出をする前のものをPCR増幅して電気泳動したものと、フェノールクロロホルム抽出をした後のものをPCR増幅して電気泳動したもので比べると、フェノールクロロホルム抽出をする前のもののほうが強いバンドが出ているので、DNAのロスがあったのではないかと考えました。 そのままでPCRがかかるならわざわざ抽出しなくていよいのでは？

まぁなんというか 削除/引用 No.3419-7 - 2010/10/26 (火) 23:37:30 - ami PCRの目的による、ってことでファイナルアンサーな気がする。 バンド出ればいいだけの実験ならProK粗抽出液で十分。

(無題) 削除/引用 No.3419-6 - 2010/10/26 (火) 23:24:43 - ソラノ > PCRを阻害します。 これはどういった理由でPCRを阻害するのでしょうか？ > フェノクロは何回していますか？タンパクが出なくなるまで？ まず、試料と等量のフェノールを加えて混和後遠心→上清と等量のフェノール：クロロホルム＝１：１混合液を加えて混和後遠心→上清と等量のクロロホルムを加えて混和後遠心→上清をエタノール沈殿→TEで溶解という手順で行っています。 > また、ODを測定していますか？ ODは測定していません。

(無題) 削除/引用 No.3419-5 - 2010/10/26 (火) 23:18:09 - ソラノ > フェノクロ前のDNAの量を測ったとしたらどういう方法ですか？ フェノールクロロホルム抽出をする前のものをPCR増幅して電気泳動したものと、フェノールクロロホルム抽出をした後のものをPCR増幅して電気泳動したもので比べると、フェノールクロロホルム抽出をする前のもののほうが強いバンドが出ているので、DNAのロスがあったのではないかと考えました。

(無題) 削除/引用 No.3419-4 - 2010/10/26 (火) 23:06:53 - ぶん >沈殿にタンパク分解酵素を加えて56℃で処理します。 NaClとSDSを加えた方が良いと思います。 >タンパクがあるとPCRに良くないことでもあるのでしょうか？ PCRを阻害します。 DNAが薄いというのは、採取した口腔粘膜から取れるはずのDNAの理論値より低いという事ですか？ どれくらいのTEに入れているかわかりませんが、単純にTEを減らせば濃度は上がりますよ。 それより、除タンパクが上手くいっていなくてDNAが汚いと言う事はありませんか？ フェノクロは何回していますか？タンパクが出なくなるまで？ また、ODを測定していますか？その時の260 280の比や230や320の値はどうなっていますか？ 抽出したDNAを泳動して確認していますか？ PCRが掛かりにくい時はDNAが少ないよりDNAが汚い可能性の方が高いです。 汚いDNAは入れれば入れるほどPCRを阻害します。

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