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(無題) 削除/引用 No.3413-24 - 2010/11/08 (月) 18:59:54 - すず ありがとうございました。 いつもお礼が遅くなってすみません。 分裂と継代数が異なるものだと学びました。 私は10回継代したのですが、その10回を分裂だと思い込んでいました。 計算も自分でやってみました。納得しました。 論文は読むのにすごく時間がかかった上に意味がわからない部分が多々ありました。 自分の英語力の無さと知識の薄さがわかりました。 丁寧に教えてくださって本当にありがとうございました。 また質問させていただく事もあるかと思いますが、よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.3413-23 - 2010/11/05 (金) 23:12:58 - み ひと言 ~ 先生が声を掛けてあげれば投稿者さんは納得するんじゃないですか？ 「ネット上での状況把握ではあるが、あなたの細胞は概算で46回も分裂していると思われるので問題ないですよ」っと・・・

(無題) 削除/引用 No.3413-22 - 2010/11/04 (木) 12:56:06 - mom-a >>あなたの培養条件が悪いと思えるか、それほど悪くもないのか…どうですか？ >条件は教科書とおりなので悪くないと思っています。 う〜ん、何となく話が通じていないような不安があるので、もう一度。 最初の疑問は『何が原因で10回しか分裂しなかったのか？』でしたよね？ で、~さんに教えていただいて、分裂と継代数について混乱していたところを整理しているわけですよね？ ここをきちんと理解できれば（先行き大事ですから、理解できるように頑張って下さいね）、 あなたの情報を元に~さんが計算して下さった結果によれば、すずさんが10回継代した間にPDLが46増えた、すなわち「46回分裂したと考えられる」ことがわかりますね？ もちろん、~さんの計算も概算ではありますが、私の意見は前回も書いたとおり。 >教科書的に50回分裂する細胞が、PDL40で増えなくなろうが60まで増え続けようが、それほど「異常」なことではないというのが私の感覚です。 それほど「異常」なことではない、というのは「普通に培養てきていると考えて実験を進めて差支えないだろう」という意味です。 で、すずさんの最初の疑問に対する答えはどうなりますか？ それはそれとして、細胞播種密度などは~さんのおっしゃるように確認しておいた方が良いと思います。今後のために。

ありがとうございます。 削除/引用 No.3413-21 - 2010/11/02 (火) 19:11:29 - すず >あなたの培養条件が悪いと思えるか、それほど悪くもないのか…どうですか？ 条件は教科書とおりなので悪くないと思っています。 採用の作業は先輩が教えてくれて問題ないと言っていただけました。 ただ電動ピペットを使うと泡が出来てしまい毎回怒られています。 英語の論文を全然読む事ができませんでした。 辞書で調べて読んでみます。 また疑問点が出てくると思うので、その時は教えてください。 蒔く細胞数は、先輩がくださった「例」に載っていた数です。 何故その数にしたのかは、何となく聞けません。 ~さんの計算も追いつかないので、持ち帰って自分で計算しなおしてみます。 作業は手取り足取り習いましたが、考え方は自分で勉強するように言われています。 やれるところまで頑張って勉強したいと思っています。 進歩が無くて歯がゆいかもしれませんが、頑張りますのでよろしくお願いします。

計算例 削除/引用 No.3413-20 - 2010/11/02 (火) 10:00:47 - ~ 5×10^3個/5mLを25cm^2に撒いたので、播種密度は2 x 10^2 cells/cm^2になります。 セミコンフルエントで継代したとして、その時の細胞密度が 0.5-1.0 X 10^4 cells/cm^2 http://www.jbc.org/content/263/22/10595.full.pdf の一番薄い0.5 x 10^4 cells/cm^2とすると、 2 x 10^2の細胞が0.5 x 10^4に分裂したので、 log(25,2)=4.6なので、1継代で4.6PDL相当、 10回継代して46PDLに相当します。 購入時のPDLを無視しても、 >50回程度分裂すると記載 から10%の誤差しかありません。 ところで、播種密度は購入元の推奨密度なのでしょうか？ http://www.sanko-junyaku.co.jp/product/bio/catalog/nhc/fibroblast-1nhdf.html の1/17.5の細胞密度で、かなりの薄撒きだと思いますが…

(無題) 削除/引用 No.3413-19 - 2010/11/02 (火) 09:38:50 - ~ >み　さん 状況確認および問題点の推定と、予想問題点についての確認が、 オンライントラブルシューティングの方向性かと思います。 後は相手のレベルに合わせてフォローしていけばいいかと。 トラブルを解決したい場合の話ですけどね。 >細胞は、25cm2のフラスコにに5×10^3個/5mLになるように蒔いています。 >希釈ではなくて個数で蒔いてしまいました。 個人的にはPDLが小数点になるので、個数で撒くのは好きではありません。 ただ、きちんとノートの記録をとっていれば、1フラスコから何mLかの細胞けん濁液を調製し、それの細胞数を数えて次のフラスコに撒き込んだかはトレースできるでしょうから、PDLでの換算は出来ますよね。 >購入元に問い合わせるのが一番早いでしょうか？ 購入元以外にその情報を知っている人がいるのでしたら、そちらに問い合わせてもいいでしょうけれども、そんな人（または団体）は存在しますか？ ただ、検索していて気づきましたが、企業が提供している細胞だとあまりPDLの情報を出していませんね。（保証問題になるのを避けるためだと思いますが） その場合は、貴方の前回行なった実験結果を元に、どの位殖える細胞かを判断することになるでしょう。 個人的には老人研の細胞が好きです。 >パッセージ3回で15PDLと言うことは、1回のパッセージで5PDLと考えてもよいですか？ シートに実験条件が書かれていないとなんともいえません。 mom-a さんが書かれているように、2^5希釈はかなりの薄撒きで、生きのいいがん細胞でもあまりしないと思います。 スタート地点が0PDLではない、既に拡大培養してストックされた細胞が作製されていて、それを起こして3継代後に実験したと思いますけど。 >つまり1回の継代で5回分裂していると言う考えでいいでしょうか？ スタート地点が0PDLであればあっています。ただ、0PDLでは無いような気がします。 >また、ロットチェック用の血清サンプルは無料でいただけますか？ メーカー次第です。出入りの業者に相談すれば有料か無料かや提供してもらえるロット数を答えてくれるでしょう。 ただ、今回は血清ロットの問題では無いと思います。 また、声をかける前にラボのボスに一言確認しておきましょう。貴方が思っているよりも、業者への"貸し"になるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3413-18 - 2010/11/02 (火) 01:24:42 - み しかし、本当に問題が起きているのかな？っと思う。 はっきり言ってネット上での他者は本当に起きている状況が何も把握できない。 まあartifactを拾わないためにも、細胞培養はしっかり習得すべきものであるのは間違いないから、初心者と言えど、基本事項を教わった上司がそばにいるなら、その人に細胞の形、増え方、あなたの手技を見てもらって意見を乞うべきだと思いますが。 たぶん百聞は・・・で終わる話だと思うけど。 やり取り見てて、同じ事を繰り返して言っているだけでいまいち進歩がない。

(無題) 削除/引用 No.3413-17 - 2010/11/01 (月) 21:53:36 - mom-a 私の経験では、正常細胞を業者が販売しているもので、凍結バイアルで売っている場合「初代培養」、フラスコに培養した状態で売っている場合「初代培養を解凍し、5日間の二次培養の後出荷」などと表記しているものがありました。 継代方法は、推奨する細胞密度を指定していますから、すずさんのように個数で播くのが間違っているわけではありません。いずれにせよ、個数を数えてあれば、何倍希釈したか計算できますよね？ ＞パッセージ3回で15PDLと言うことは、1回のパッセージで5PDLと考えてもよいですか？ 数え方としては良さそうですが、32倍希釈というのは、正常細胞にしては希釈しすぎなような気がします…でも、トリプシン処理の回数が多いのが良くないといって薄めに播いていた人もいるので、私には何ともいえません。そのあたりも含めて、購入元が分かっていればそこへ問い合わせるのが一番早いと思います。 ロットチェック用の血清についても、出入りの業者さんに問い合わせてみれば良いと思います。私は無料サンプルを貰いましたが、ただし、かなり大量にまとめ買いしました。 ところで、No.3413-13の~さんの質問に戻って、前述のように個数が数えてあれば、おおまかな希釈倍率が計算できますよね？そうすると、10回継代でいくつPDLが進んだか目安がつくのではないですか？1つや2つや3つ数がずれていても構わないのです。大体の目安はつきませんか？ すずさんの手元にくるまでにも数回分裂していること、凍結解凍で少しダメージがあることなども考慮して、あなたの培養条件が悪いと思えるか、それほど悪くもないのか…どうですか？ 教科書的に50回分裂する細胞が、PDL40で増えなくなろうが60まで増え続けようが、それほど「異常」なことではないというのが私の感覚です。 ちなみに、私が以前購入した正常ヒト皮膚線維芽細胞は、データシートの保障継代次数は「3次培養まで」となっていました。 実際にはもっと継代できますが、どのくらい継代可能かということは血清のロットもそうですが、使用する培地や継代のタイミング、薄く播いたり濃く播いたり、といったことでかなり変わってきますので、メーカー側としては保証できない、というところなのだと思います。 体調が悪そうなところへ長文で失礼しました。頭をすっきりさせてから、もう一度No.3413-13&14を良く読まれると良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.3413-16 - 2010/11/01 (月) 19:08:42 - すず 継代回数と分裂回数が異なるというのは理解できました。 ありがとうございました。 細胞は、25cm2のフラスコにに5×10^3個/5mLになるように蒔いています。 希釈ではなくて個数で蒔いてしまいました。 入手時のPDLは購入した方に再度聞きましたが、知らないと言われました。 データシートを読みましたが記載はありませんでした。 購入元に問い合わせるのが一番早いでしょうか？ データシートに、パッセージ3(15CPD)でfunctional testをやったと書かれていました。 入手時のPDLとは話がずれていますが、確認させてください。 パッセージ3回で15PDLと言うことは、1回のパッセージで5PDLと考えてもよいですか？ 先ほど教えていただいた希釈の考え方で、2^5=32だから、32倍希釈して蒔きなおして一杯になったときが5PDL、つまり1回の継代で5回分裂していると言う考えでいいでしょうか？ また、ロットチェック用の血清サンプルは無料でいただけますか？ やはりまだ不調なので今日は帰ります。 またお礼が遅くなるかも知れません。すみません。

ありがとうございます。 削除/引用 No.3413-15 - 2010/11/01 (月) 13:52:59 - すず お礼が遅くなる申し訳ありません。 食あたりで酷い目にあいました。 午後からようやく顔を出せました。 再度いただいた回答を再度自分で読み込んでみます。 本当にありがとうございます。

追加 削除/引用 No.3413-14 - 2010/10/28 (木) 01:37:29 - ~ PDLが意味する細胞分裂の回数は、個々の細胞の分裂回数ではなく、集団としての分裂回数です。そのため、PDLが1増えたからといって全ての細胞が1回分裂したとはいえません。 供給元によっては、細胞の現時点でのPDLは厳密な数字ではなく、大体いくつというものや、不明のものもあります。PDLは継代する人によって結構ずれるので、大体の数字でもその数字でカウントしていけばそれほど困らないと思います。不明のものは個人的には選ぶべきではないものだと思っています。 正常繊維芽細胞は老化する前にどんどん分裂速度が遅くなります。どの位の期間観察して分裂が止まったと見なしたのか分かりませんが、細胞が少し平べったくなったと思っても、1〜4PDL分くらい分裂するかもしれません。 http://proteome.tmig.or.jp/pjtdb/Kenkyu/Cell_culture/Hayflick_model.html の図1の相3のことです。 正常繊維芽細胞が老化してくると分裂速度が遅くなりますが、代謝はしています。そのため、継代をするだけの細胞密度にならなくても、週１〜２回くらい培地交換をしてあげないと細胞が死ぬことがあります。 Dimri GP, Lee X, Basile G, Acosta M, Scott G, Roskelley C, Medrano EE, Linskens M, Rubelj I, Pereira-Smith O, Peacocke M, Campisi J. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Pro Natl Acad Sci USA 92:9363-9367, 1995 で報告されている老化マーカーで染色した写真を取っておくと、老化している細胞を使ったデータであることを示しやすくなります。

(無題) 削除/引用 No.3413-13 - 2010/10/27 (水) 22:08:32 - ~ >例えば1つの細胞が2つになるのに2日かかるとしたらPDLが2だと思っていますが、それで大丈夫でしょうか？ mom-aさんが書かれている通りですが、 簡単に言うと、PDLは細胞を個体から取り出してから何回分裂したかの"回数"を意味します。 もし50PDLで分裂停止する細胞を扱っているのでしたら、貴方が入手する前の分裂回数と、貴方が飼っている間の分裂回数が合わせて50回(PDL)に達したら、細胞老化が起き、分裂しなくなります。 >私は継代のつもりで書きました。10回ほど植えついだら分裂しなくなりました。 継代回数と分裂回数が異なるというのは理解できましたか？ 例えば元のシャーレが一杯になった状態で1/8に希釈して新しいシャーレに撒き、再度シャーレが一杯になったら、1/8希釈から８倍に増えたので、8=2^3で3回分裂し、3PDL増えたと考えます。 そのため、正常繊維芽細胞を扱う時には、細胞密度を合わせて継代するよりも、2倍、4倍、8倍と2の倍数で希釈した方がPDLが管理しやすいです。 2倍に希釈した細胞がコンフルエントになったら１PDL増加、4倍だと+2PDL,8倍だと+3PDLになります。 (16倍希釈だと薄すぎて増殖が悪くなることがあります) >購入時点のPDLはシートに記載が無ければ判らないと言われました。 では、シートを見ましょう。シートに書かれていなければ、購入元に問い合わせましょう。 細胞は決して安いものではありませんし、研究に使う以上は基本的にはトレースできることが求められます。実験によっては、若いPDLと細胞老化よりちょっと前のPDLの細胞は区別して扱われます。 貴方が血統書付きのイヌをドッグコンテストに出したい時に、血統書が付いているか分からないイヌをとりあえず飼い始めることはしないはずです。 >細胞をくれた方は、がん細胞しか扱ったことが無いとお聞きしました。 先輩が必ずしも貴方よりも知識があると信じてはいけません。 （先輩が貴方よりも劣っていると考えている態度を見せてもいけません） >まず最初に線維芽細胞が何回分裂するのか調べなさい、50回ほど分裂するからそのつもりでと言われました。 >やってみたら10回くらいしか分裂しませんでした。 分裂回数を調べる事を求められているのに、10回という継代回数を数えていますよね。 貴方が継代ごとに何倍に希釈して撒いたのかで、分裂回数が変わってきます。 要求されたことを調べましょう。 >もしも繊維芽細胞には適さない血清だったとして、繊維芽細胞に適する血清をどうやって探せばよいのでしょうか？ 貴方が求める血清の規格を定め、血清メーカーにロットチェック用の血清サンプルを要求し、自分で培養してその規格を満たす血清であるかを確認します。 ただ、貴方の場合は継代ごとの希釈倍率が書かれていませんし、ロットチェックのために10回も継代するのは現実的ではありませんので、貴方の求める血清で無かったかどうかは要検討です。 例えば継代ごとに10倍に細胞を薄めて撒いたと仮定すると、1継代ごとに10=2^3.3で、3.3PDLずつ増えてきます。10回継代したので貴方の操作で33PDL増えました。元のPDLが20PDLであることを貴方が確認したとすると、計53PDLになります。貴方が見つけた50PDLで老化するという情報よりも3回多く分裂していますので、分裂がおかしいという結論は得られません。 �@貴方が1継代ごとに何倍に希釈し、それが10回の継代で合計何PDLに相当するか �A入手時のPDLはいくつか の2点を確認しましょう。

ありがとうございます。 削除/引用 No.3413-12 - 2010/10/27 (水) 18:10:24 - すず mom-a様 ありがとうございます。 もう少し調べてから~様にお返事いたします。 まだ調べたり無いようで、今しばらく時間をください。 頑張りますので、またよろしくお願いします。

横からですが、ひとつだけ。 削除/引用 No.3413-11 - 2010/10/27 (水) 13:44:23 - mom-a 横から口をはさむのは混乱するだけで良くないと思いましたが、1点だけ。 >継代回数は、細胞を剥がして再度まいた回数で、PDLは細胞が2倍の量になる時間でよいでしょうか？ >例えば1つの細胞が2つになるのに2日かかるとしたらPDLが2だと思っていますが、それで大丈夫でしょうか？ これは間違いです。PDLが示すのは「時間」ではありません。結構調べにくいんでしょうか。 PDL（population doublig level）、日本語だと「集団倍化数」と書かれることが多い気がします。 これでもう一度調べて~さんへの返事を書きなおしてみては？ 線維芽細胞は、正常細胞の中では比較的よく増えるほうですし、扱いやすいので…雑に取り扱っているケースがままあるような気がします（苦笑）使用目的によっては、あまり厳密にPDLのチェックをせず、起こしてから○○くらいは培養していて大丈夫〜増えなくなったらストックを起こそう〜なんて感じで。こういう扱いをしていると、人に譲るときには困りますね。

ありがとうございます。 削除/引用 No.3413-10 - 2010/10/27 (水) 11:48:14 - すず 間違いがあれば指摘してください。お願いします。 >継代回数とPDLの違いは分かりましたか？ 継代回数は、細胞を剥がして再度まいた回数で、PDLは細胞が2倍の量になる時間でよいでしょうか？ 例えば1つの細胞が2つになるのに2日かかるとしたらPDLが2だと思っていますが、それで大丈夫でしょうか？ >貴方が書いたのはどちらでしたか？ 私は継代のつもりで書きました。10回ほど植えついだら分裂しなくなりました。 >入手時と現時点のPDLが分からないのでしたら、問題が起きているのかすら分かりません。 細胞をもらった人に聞いてみたらデータシートを渡され、購入時点のPDLはシートに記載が無ければ判らないと言われました。 細胞をくれた方は、がん細胞しか扱ったことが無いとお聞きしました。 >また、正常繊維芽細胞を扱う理由と目的は認識していますか？ シャーレ1枚分の細胞が10回分裂したのであれば、シャーレ1000枚分くらいになります。 それでも細胞が足りない実験なのか、50PDL位の老化した細胞を扱いたいのかのどちらかなのでしょうか？ まず最初に線維芽細胞が何回分裂するのか調べなさい、50回ほど分裂するからそのつもりでと言われました。 やってみたら10回くらいしか分裂しませんでした。 >がん細胞と違って、とりあえず飼っておくというのは止めましょう。 正常繊維芽細胞は有限で、貴方が買っている間にPDLが消費されていきます。 はい。ありがとうございます。 >他の細胞で問題なくても、その細胞で問題があれば問題です。 そのため、他の細胞培養で問題がないだけの血清ロットであって、正常繊維芽細胞で問題が無いか分からない血清であることを認識して使いましょう。 はい。すごく納得しました。 もしも繊維芽細胞には適さない血清だったとして、繊維芽細胞に適する血清をどうやって探せばよいのでしょうか？ >そのため、細胞を起こす前の時点で貴方がおかしい操作（または考え方）をしていると指摘されている部分は明確にしておきましょう。 はい。わからないことばかりで泣きそうですが頑張ります。 またアドバイスをお願いします。

(無題) 削除/引用 No.3413-9 - 2010/10/27 (水) 11:10:32 - ~ 継代回数とPDLの違いは分かりましたか？ 貴方が書いたのはどちらでしたか？ 正常繊維芽細胞を扱うのであれば、PDLの考え方が必要です。 入手時と現時点のPDLが分からないのでしたら、問題が起きているのかすら分かりません。 >買ってすぐの細胞を培養して増やした後に-80度で冷凍して 購入元次第ですが、買った時点で結構PDLが進んでいる(20PDL以上の)ことがありますよ。#2に書いている�Aと合わせれば、何も問題は起きていません。 また、保存した人が分裂させたのが1回なのか、何回なのかは確認し、区別しましょう。 （保存した人が実際にその様に発言したのであれば、ラボ自体が正常細胞をあまり扱っていないのでしょうか？そうであれば、実際に実験する貴方が調べて周りを教育しましょう） また、正常繊維芽細胞を扱う理由と目的は認識していますか？ シャーレ1枚分の細胞が10回分裂したのであれば、シャーレ1000枚分くらいになります。 それでも細胞が足りない実験なのか、50PDL位の老化した細胞を扱いたいのかのどちらかなのでしょうか？ がん細胞と違って、とりあえず飼っておくというのは止めましょう。 正常繊維芽細胞は有限で、貴方が買っている間にPDLが消費されていきます。 >血清は、他の細胞培養でも用いていて問題なかったそうです。 他の細胞で問題なくても、その細胞で問題があれば問題です。 そのため、他の細胞培養で問題がないだけの血清ロットであって、正常繊維芽細胞で問題が無いか分からない血清であることを認識して使いましょう。 貴方が10回と書いているのが分裂回数か継代回数か分かりませんが、 10回分裂であれば、２、３継代分なのでロットチェックではねれるでしょう。10回継代であればロットチェックでははねられませんが、はねられないからと言って問題のない血清であるとは言えません。 >同じ条件で同じ事をやっても結果も同じだと思い悩んでいます。 細胞が同じで、貴方が同じ操作をすれば、結果は同じになることが期待されます。 そのため、細胞を起こす前の時点で貴方がおかしい操作（または考え方）をしていると指摘されている部分は明確にしておきましょう。

ありがとうございます。 削除/引用 No.3413-8 - 2010/10/27 (水) 10:35:50 - すず 保存された方に聞いてみたら、買ってすぐの細胞を培養して増やした後に-80度で冷凍して、その細胞を私にくださったそうです。 分裂回数は、1回〜数回程度でしょうか。 non-essential amino acidは添加していません。 血清は、他の細胞培養でも用いていて問題なかったそうです。 もう1つ細胞を渡すから同じ実験をやってみてと言われましたが、同じ条件で同じ事をやっても結果も同じだと思い悩んでいます。

(無題) 削除/引用 No.3413-7 - 2010/10/26 (火) 16:03:26 - masa ~ 様が書かれていることと殆ど一緒ですが、 すず様が培養を開始した時点で分裂回数が０からスタートではないという点と、継代一回＝細胞分裂一回ではないということです。

(無題) 削除/引用 No.3413-6 - 2010/10/26 (火) 16:02:35 - み 培養開始した時点でいったいその繊維芽細胞は何回分裂していたのでしょうか？ 細胞の履歴が不明なら検討つきません。 あなたが採取された初代培養細胞ですか？ 誰かからもらった細胞ですか？ 採取方法が悪くて弱っていた可能性、保存状態が悪くて弱っていた可能性。 あなたの継代方法が悪い可能性。 non-essential amino acidを添加するプロトコールですかね。 そのあたりの条件が不適切など色々考えられますが、 分裂回数が有限である初代培養を扱っている以上、何も不思議とは思わない。

(無題) 削除/引用 No.3413-5 - 2010/10/26 (火) 15:46:50 - すず み様 ありがとうございます。 線維芽細胞は不死化した細胞では無いです。 ですが通常は50回程度分裂するはずが10回程度しか分裂しませんでした。 その原因がわからず質問させていただきました。

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