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(無題) 削除/引用 No.3412-13 - 2010/10/29 (金) 04:34:39 - おお >ポリA20マー位プラスジャンクションの配列数塩基加えたプライマーなら 実際リバースプライマーになりますので プライマー自身はポリTになります。あしからず。

(無題) 削除/引用 No.3412-12 - 2010/10/29 (金) 04:31:22 - おお >ノザンブロットは数回行いましたが結果が出ていません。 結果が出てるんでなくて、系がうまく働かなかったって言う事?

(無題) 削除/引用 No.3412-11 - 2010/10/29 (金) 04:29:22 - おお >こういう実験を組んだことはありませんが、RNA抽出の際のDNAのコンタミは必 ずあります。 じつはたまにやりますが、DNaseの消化の具合次第だと思います。 たいていキットでOn column digestionをするのですが、その系だと 良好です(短いのはカラムからリリースされるんでしょうかねェ)。 でもちょっと雑になるとシグナルが出ることがあります。 たしかに発現量とコンタミDNAの量的の差が十分あるかないかという のはあるかもしれません。 もしDNAのシグナルを抑えタイのであれば、イントロンの利用は てなのですが、こういうプラスミドのばあいとか利用できない場合も あります。ちょっとした案ですが、ポリAサイトが分かっているなら、 ポリA20マー位プラスジャンクションの配列数塩基加えたプライマーなら うまく行くかもしれません。実際にやったことはありませんが、 興味がありましたら。。。。

(無題) 削除/引用 No.3412-10 - 2010/10/28 (木) 22:19:26 - ザンギ こういう実験を組んだことはありませんが、RNA抽出の際のDNAのコンタミは必 ずあります。 プラスミドのコピー数が多い場合には、RT-PCRで増えない程度にゼロに近づける ことは多分不可能です。 プラスミド上の翻訳されない部分の配列を検出するPCR系を並列して走らせて、 コンタミDNA量を同時に定量して標的配列から引き算するのが現実的かと思います。

(無題) 削除/引用 No.3412-9 - 2010/10/28 (木) 15:08:36 - Pumpkin RT-PCR以外での検出法で検証ということでしたら、やはりハイブリになると思うのでnorthernでしょうね。 ハイブリしてもDNAを消化出来ていなければ、ハイブリしてしまって、結局RT-PCRで苦労している点に立ち戻るんじゃないですか？ というか、pGL3に入れているということは発光量もみているんですよね？ 蛋白量で見ているわけだから、そこで差をとれないんですか？

(無題) 削除/引用 No.3412-8 - 2010/10/28 (木) 11:53:06 - ぷりんす ノザンブロットは数回行いましたが結果が出ていません。 non-RIは条件さえ整えばRIと同等の結果が出るそうですが、条件検討の時間を考えてもRT-PCRの方が良いと思うので、現在はRT-PCRを中心にRNA測定をしています。

(無題) 削除/引用 No.3412-7 - 2010/10/28 (木) 11:37:05 - おお �CDNase処理のあとに、フェノクロでなくて、トライゾールを使うと ましになるだろうと思えます。トライゾールはDNAを除く 試薬ですので。 non-RIドット(スロット)ブロット。 >ノザンブロットは既に試しました。 で、結果は? 結果出てるんだったら、、、

(無題) 削除/引用 No.3412-6 - 2010/10/28 (木) 11:09:02 - ぷりんす もう少し具体的な内容を話しますと、 pEGFPc1ベクター（内部標準）・pGL3promoterベクターを導入し、pGL3にはある遺伝子の3'UTRの一部を組み込みその配列機能を調べています。 RT-PCRで検出orそれ以外の効率的な検出方法はありますか？non-RIによるノザンブロットは既に試しました。

(無題) 削除/引用 No.3412-5 - 2010/10/25 (月) 16:49:31 - Pumpkin みなさんのおっしゃる通り、 gDNAでなくてplasmidの問題ですね。 訂正します。

(無題) 削除/引用 No.3412-4 - 2010/10/25 (月) 16:33:50 - in situ ambionのテクニカルのページなどで取り上げられていますが、通常のDNase処理だとDNAを完全に分解できません。というか結構残ります。 特にプラスミドで遺伝子導入した場合、コピー数が結構多いので定量上問題になりますよね。 ambionから出ているturbo DNaseを使えば若干改善します。 あとは、RT-PCRならintronを挟むようにプライマーを設計して区別するとかでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3412-3 - 2010/10/25 (月) 16:32:51 - masa 私も同じような経験がありますが細胞に導入したplasmidが大量すぎて、DNase処理が不十分な可能性が高いと思います。 plasmidを導入していないサンプルで同様のトラブルが起きるのであれば、器具の汚れを疑いますが、そうでなければDNaseのunit数やインキュベーション時間の延長を検討してみてはいかがでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3412-2 - 2010/10/25 (月) 16:14:43 - Pumpkin １．単にDNase処理が不十分でgDNAが消化されていない ２．ピペットマン、チップや試薬類からのDNAの汚染 が考えられるでしょう。 チップはバリアーチップを用いて、試薬類は新品を使って同じことが起こるのであれば、gDNAの消化不良の可能性が高くなりますよね。

トランスフェクション細胞からのRNA抽出 削除/引用 No.3412-1 - 2010/10/25 (月) 16:09:53 - ぷりんす EGFPやLucのmRNA量を見たいのですが、 �@C6細胞にトランスフェクション �Aトライゾールで回収 �BRNA抽出 �CDNase処理 �Dフェノール/クロロホルムで抽出 �ERT-PCR �FPCR �Gアガロース電気泳動 の手順で行っているのですが、�ERT-PCRを掛けずにPCRを掛けたもので、EGFPやLucがクローニングされ�Gでバンドが確認されてしまい、RNA量が測定できません。 何が問題なのでしょうか？ 基本的に実験は全てDNase・RNase freeの水で実験しています

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