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(無題) 削除/引用 No.3410-16 - 2010/10/27 (水) 12:15:36 - Pumpkin もろこしさん、ご苦労様でした。 起きるには起きるようですね。 あとは生存率とか色々気になりますが、 とりあえずは起きると言うことですね。

(無題) 削除/引用 No.3410-15 - 2010/10/27 (水) 12:00:53 - もろこし グルコースストック菌、培地に生育しました。 ただし日時経過が短いため、もう少し経ってからまた撒いてみても良いかな…と考えています。

(無題) 削除/引用 No.3410-14 - 2010/10/26 (火) 13:48:50 - もろこし いつのまにかこんなにご意見が…ありがとうございます！ 現在グルコースストックしてしまった菌をプレートに撒いています。 結果は明日お教えします！

(無題) 削除/引用 No.3410-13 - 2010/10/25 (月) 19:19:12 - Ｔ もちろん、現実の選択として標準的なプロトコールでやり直すという対処法は当然ありうるでしょう。 何かある度に車輪を再発明してまわるわけにはいきませんから。 ただ、いかにも理論的かつ実験的な裏付けがありそうな感じで一刀のもとに否定をするのは研究者としてどうでしょうか。 原理に遡って疑問を持つのは正しい科学的好奇心だと思いますし、そこから何かが生まれる事もあると思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.3410-12 - 2010/10/25 (月) 19:03:42 - Ｔ PMID: 6408064 では大腸菌を 15% グルコース添加ＬＢで培養し、それを凍結して電顕用のサンプルを作ってます。起こし直したわけではないですが、氷晶ができない事を目的にしている点では凍結保存と同じでしょう。少なくともこれくらいの濃度では大腸菌はピンピンしていて、ちゃんと増殖するわけです。 また、ある程度の時間が経てば高濃度グルコースも細胞内に浸透する事も分かりますが、それがどれくらいのスピードかは誰も知らないと思います。（どなたかご存じなら教えてください）凍結処理にかけた時間や、温度低下の速度にもよるでしょうし、結局はやっぱりやってみないと。 少なくとも、現時点で手に入る証拠で何かを断言するのは、思考停止を意味すると思います。 もちろん、実際にルーチンで使うかどうかは別問題ですが。

(無題) 削除/引用 No.3410-11 - 2010/10/25 (月) 19:02:05 - Pumpkin >PMID: 17478061 ではブタ卵子の凍結に・・・ 色々と例をお示し頂きありがとうございます。しかし、そういういわゆる特殊なプロトコルは、やはり一般的な概念とはならないのだと思います。一般的な概念が通用しないから、あれこれと思案してたどり着いたプロトコルがお示しいただいた例ですね。 >そのような非標準的方法でリスクを冒すというのは、私ならやりません。 まさに中年さんの意見がただしいのかと思います。新しい凍結保存法の開発というのであれば良いと思いますが、確立されたプロトコルがある以上、それを使うことは意義があって、大事だと思います。 >ばかげたと思える条件でもどうなるかをやってみるのは大事と思います。 上に書きましたように、新たな開発が目的であれば、違う角度から攻めてみると言うのは大事ですね。 ということで、やはり私としては、比較ができるこれまでの方法でやり直すことをお勧めし、時間的余裕を自身の興味があればグルコースストックから起こしてみて、知見を獲得されてはいかがでしょうか。何度も言いますが、やったら結果を教えてくださいね。

(無題) 削除/引用 No.3410-10 - 2010/10/25 (月) 18:37:35 - よど たしかに精子や卵子保存の場合は、あり得ないと思えるような条件でも、実はそれが良いということもあるようですね。ethlene glycolなんて確か解糖系を阻害する強い細胞独だったような気がしますが。ただ普通の培養細胞ではこんな条件はうまくいかない気がします。 とはいえ、ばかげたと思える条件でもどうなるかをやってみるのは大事と思います。Alkali-SDS lysisする前にRNaseを菌体懸濁液に加えてしまったがそれでRNase処理になるだろうか、なんてことを学生に聞かれたら、なるわけないだろ、というに決まってますが、今では普通にやってるプロトコールですよね。高浸透圧の細胞への作用はたいへん複雑で予測できません。

(無題) 削除/引用 No.3410-9 - 2010/10/25 (月) 18:26:38 - 中年 グルコースが使えないという強い証拠を持っている訳ではありませんが、適切な凍結補助剤であるためには、氷晶の形成を抑える作用に加えて、その凍結過程の時間内に凍結されるべきその細胞の中心まで浸透している必要があります。菌株というのがバクテリアか真菌か分かりませんが、グルコースがそんなにスカスカ通るものでしょうか。 いずれにせよ、そのような非標準的方法でリスクを冒すというのは、私ならやりません。

(無題) 削除/引用 No.3410-8 - 2010/10/25 (月) 18:23:23 - Ｔ > 0.5Mといっても9%ですよね。 ではこういうのはどうですか。 PMID: 17478061 ではブタ卵子の凍結に ethylene glycol と組み合わせて最高 2.0M グルコースを使っています。36% 相当ですね。それでもちゃんと生き返っているようですよ。

(無題) 削除/引用 No.3410-7 - 2010/10/25 (月) 18:03:23 - Pumpkin Tさんがご指摘のように私の直感を押し付けた点は反省します。 また、実際に大腸菌を50%グルコースで保存したことがないので、 だめだということも言えないですね。 もろこしさんが起こしてみて起きるかどうかをやって頂くしかないのですが、 それにしてもグルコース濃度30%〜50%ですよね？植物なんかでも低温に対して糖（主にスクロースや糖アルコールですが）が凍結防止剤として蓄積されることはよく研究されています。しかし、いくらなんでも高いのではと。おしめしになった原虫を良く知らないのであれですが、0.5Mといっても9%ですよね。 >グリセロールストックだってプロトコールによって 10%〜50%くらいまで幅 グリセロールとグルコースでは全然浸透圧が違う気もするのですが、結局は試したことないので、だめだとは断言できません。 グリセロールストックを作り直しつつ、今のグルコースストック（？）を起こし直してみるのがいいかもしれませんね。もしやったなら、結果を教えてください。

(無題) 削除/引用 No.3410-6 - 2010/10/25 (月) 17:33:04 - Ｔ 言うほど直感的に明らかではないと思いますよ。 グルコースも cryoprotectant として使われる事があります。 例えば PMID: 7398365 ではある種の原虫の凍結に使っています（0.1M to 0.5M）。 その濃度（final 30%?）でどうか、大腸菌でどうかというのは、やってみないと一概には言えないと思います。 私はむしろ、生き残っている可能性大だと「直感的には」思います。 グリセロールストックだってプロトコールによって 10%〜50%くらいまで幅があるわけですし、大腸菌がさほど浸透圧に脆弱だとは思えないのですが。

(無題) 削除/引用 No.3410-5 - 2010/10/25 (月) 16:39:54 - もろこし ＞Pumpkinさん 恥ずかしながら（ピー）年生です…。 くらい恥ずかしながら勉強になります…。 丁寧な回答、有難うございます。

(無題) 削除/引用 No.3410-4 - 2010/10/25 (月) 16:11:48 - Pumpkin もろこしさんが、何年生かはわかりませんが、 この程度は直感的にもわかって貰いたい気がするのですが。。。 １．菌株を保存するときの凍結補助剤（グリセロール等）の意味 ２．浸透圧とは といったところでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3410-3 - 2010/10/25 (月) 16:02:08 - もろこし >中年さんへ 回答ありがとうございます！ 30％になるように調整するという意味です。 スミマセン、どういう原理で菌が死んでしまうのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3410-2 - 2010/10/25 (月) 15:52:33 - 中年 「30％にアップして」という操作が何を指しているのか不明ですが、グリセロールの代わりにグルコースを使ったということだけから判断すると、菌はほとんど死んでるでしょうね。

グルコース×→グリセロール○菌体ストック 削除/引用 No.3410-1 - 2010/10/25 (月) 14:55:48 - もろこし 従来、液体培地で培養した菌体を、50％グリセロールを30％にアップして−80℃で保存していましたが、我ながら阿呆なコトに、今日たまたま50％『グルコース』で保存してしまいました（汗 でも実のところ、影響はあるのでしょうか？ …と今疑問に感じております。 しょーもない質問かもしれませんが、宜しければご意見をください。

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