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(無題) 削除/引用 No.3397-13 - 2010/10/26 (火) 19:45:11 - く 特異的な抗体を作ろうとしているのでは？ Ni-NTA-HRPはどうでしょう

(無題) 削除/引用 No.3397-12 - 2010/10/24 (日) 14:39:52 - おお 特異的なこうたいがあればねぇ。。。

(無題) 削除/引用 No.3397-11 - 2010/10/24 (日) 13:05:07 - ATGC なにもしてない細胞でも出てるけど感染させたやつよりもシグナルが弱いということはもしかするともしかしたら混じったのかもね。２レーンくらい空けた方がいいね。もし混じったとすると、97KDaのやつは発現させた蛋白質かもね。まずそこをはっきりさせる事が必要だね。あとSDS-PAGEの分子量が理論値とかなり違う事はたまにあるよ。翻訳後修飾とか、アミノ酸組成の偏りとかいろいろな理由で。His-tag抗体と反応する蛋白質はわりとあるよ。Pubmedからprotein-blast行ってHHHHHHって入れて検索してみ。いろいろ出てくるよ(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。配列的にHが近くに集まってるのも含めたらもっとあるとおもう。

(無題) 削除/引用 No.3397-10 - 2010/10/23 (土) 23:36:16 - Actias っていうか、目的タンパクが見えてないほうが深刻じゃん。 インサートが悪い インサートは良いけど作ったベクターが悪い 作ったベクターは良いけど発現しない 発現してるけどトランスファーできない トランスファーできたけど1次抗体がくっつかなく検出できない 1次抗体がくっつくけど2次抗体がくっつかなく検出できない 2次抗体がくっついてるけどhrpが死んでて検出できない どこがおかしい？ ポジコンとして、そのベクターで大腸菌でタンパクを発現させるとか、できないの？ 無理なら、同じ由来のcDNA で大腸菌（でなくても哺乳動物細胞でもいいけど）で発現させたHis-tag付きタンパクとか。 1次抗体のドットブロットで2次抗体がくっつくか 2次抗体のドットブロットは？ RT-PCRでベクターから発現してる？ 思いつくまま書きましたが、おえるポイントはいくつもある。

(無題) 削除/引用 No.3397-9 - 2010/10/23 (土) 22:15:46 - Jack うさん > ちゃんとnegaconを置かれてるんですね失礼しました。 いえいえ。私の説明不足でした。申し訳ありません。 > 内在性のpoly histidineを持つタンパク質はかなり多いですよ。 そうなんですか。情報有難うございます。 しかし、複数のバンドが確認できればそうであると思うのですが、今回は只一つのバンドしか検出されなかったもので・・・・。 > Jackさんが発現させたい蛋白は何kDaですか？ 76kDaです。しかし、検出したバンドサイズは97kDa位なので、これは目的蛋白では無いのかなと思っています。

(無題) 削除/引用 No.3397-8 - 2010/10/23 (土) 22:10:04 - Jack ＞Actiasさん、＞Aさん ご指摘ありがとうございます。 二次抗体のネガコンはしていませんでした。

(無題) 削除/引用 No.3397-7 - 2010/10/23 (土) 10:54:09 - う ちゃんとnegaconを置かれてるんですね失礼しました。 内在性のpoly histidineを持つタンパク質はかなり多いですよ。 実際、感染させていないSf21の細胞抽出液をNiカラムにかければ、かなりの内在性poly histidine bearing proteinsがtrapされていることが分かります。 Jackさんが発現させたい蛋白は何kDaですか？

(無題) 削除/引用 No.3397-6 - 2010/10/23 (土) 02:01:00 - A Actiasさんおっしゃっている二次抗体のほかに今回の一次抗体と 同じanti-Hisではないmouse IgGでも反応してしまうのかもしれ ないですね。

(無題) 削除/引用 No.3397-5 - 2010/10/22 (金) 20:43:04 - Jack うさん ご指摘ありがとうございます。 言葉足らずでスイマセンでした。 ネガコンとして感染していない細胞からの抽出液を用いました。そこでも同一サイズにバンドを確認しました。さらにサンプル、ネガコン共にそのバンドしか検出されず、非特異的にしては特異的過ぎるのではと思っています。 そこで、内在性のタンパク質でHis-tag抗体に反応してしまうものがあるのか気になり相談しました。 しかしタンパク質濃度をそろえて泳動したのにも関わらず、ネガコンはサンプルよりも検出感度が低く、もしかしたらローディングする際に僅かながらサンプルがコンタミしてしまったのではとも考えています。 検出にはECLを用いました。

(無題) 削除/引用 No.3397-4 - 2010/10/22 (金) 20:30:01 - Actias 他人があるかどうかではなく、ネガコンをおくのが普通。 2次抗体のみのネガコンもお忘れなく。

(無題) 削除/引用 No.3397-3 - 2010/10/22 (金) 17:34:44 - おお あるだろうなぁ。。。

(無題) 削除/引用 No.3397-2 - 2010/10/22 (金) 16:40:56 - う ご自身のお書きになった文章をよく確認してからトピックは立てた方がいいですよ。 ウイルスを感染orバクミド導入したものとそうしなかったものとで、そのbandは比べましたか？

Sf21細胞とHis-tag抗体について 削除/引用 No.3397-1 - 2010/10/22 (金) 16:35:46 - Jack こんにちは。毎回色々と勉強させていただいています。 Sf21細胞を用いて6×His-tag付きの発現を確認するため、6×His-tag抗体 (BioDymamics Laboratory社) を用いてウエスタンを行いました。 すると、約97kDaに単一のバンドが検出されました。 そこで、質問なのですが、 Sf21細胞の内在性タンパク質で6×His-Tag抗体と反応するタンパク質があるという事を経験 or 聞いたことある方はいらっしゃいますか？

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