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(無題) 削除/引用 No.3395-7 - 2010/10/24 (日) 20:48:53 - あべちゃん 私の場合、 1mm厚、4mm幅のコームで 5-10 uL/laneです。 ミニゲルの場合、 サンプルがゲル内に入るまでは30V定電圧（だいたい2mA位）。 サンプルがゲルに入った後は、10mA定電流。 といった具合です。 はじめから10mAにすると、私の場合、「コ」の字というよりバンドが丸い形になってしまいます。

(無題) 削除/引用 No.3395-6 - 2010/10/23 (土) 20:40:07 - tki ボリュームというよりは、ウェルにいれた時の嵩高さですね。 ウェルの幅とゲルの厚みが効いてきますが、少ないにこしたことはないですね。 解析に支障のない範囲で妥協するのがいいんではないでしょうか。 ゲルを保存するときはスタッキングゲルを重層する前のほうがいいかもしれません。 スタッキングゲルはバッファーが違いますよね？

(無題) 削除/引用 No.3395-5 - 2010/10/23 (土) 10:47:28 - native tki様 ずばりtechnicalなポイントをありがとうございます。 大変嬉しいです。なるほど、volumeなんですね。 native PAGEで一般的に見られる現象ということで大変安心しました。 現在、サンプル10 ulに、等量の2xsample buffer 10 ulを加え、これを20 ul/laneで加えておりますので、今後、sample bufferの濃度を濃いめにして流してみたいと思いますm(__)m ちなみに、tki様も私と同じmini gelでしょうか？ 1 laneあたりに何ulほど流していますか？ 現在20 ul/laneですが、17.5 ul/laneや15 ul/laneでbandの現れ方は随分変わりますか？ 差し支えなければ教えてください。

(無題) 削除/引用 No.3395-4 - 2010/10/22 (金) 22:16:17 - tki 泳動初期にはウェルからゲルの中へのサンプルの拡散があります。 ウェルの土手の部分へは横方向の拡散になります。 土手のゲルに入った試料液は電場方向へ泳動されますが、土手の高さのぶんだけ 泳動が遅れるのでパターンの乱れになります。 SDS-PAGEなどでも同じ現象は起こりますが、native-PAGEは影響が大きいようです。 試料液のボリュームを抑えるのが改善策になります。

(無題) 削除/引用 No.3395-3 - 2010/10/22 (金) 20:53:05 - native あべちゃん様 アドバイスありがとうございます。 >ペリスタとグラジェントゲルメーカーで自作してます。 やはり自作には問題はなさそうですね。。 私はgradient gelではなくnon-continuous gelですが、カレントプロトコール通りに作製しているのですが。。 >いつも勾配ゲルの上に載せてます。スタックさせると言うより、勾配が崩れないようにコームを挿すには必要です。 stack gelは作製されておられるんですね。よかったです。参考になりました。 すると私の、ゲル泳動パターンに再現性が取れない原因究明はまずまず困窮を極めそうですね。 サンプルをwellにアプライ後、電流を10 mAほどかけ、５分ほど泳動を見ているんですが、なぜかサンプルがwellの底にだけでなく、左右のwell壁にも引き寄せられます。つまりカタカナの「コ」の字を時計回りに90℃回転させた感じでseparation gelに入っていきます。 separation gelの上から1/4にBPBが来たところでもう一度bandを見ると、「コ」の字を時計回りに90℃回転させた感じはなくなりlinearというか普通の泳動パターンになります。 最終的にwestern blotを行うと興味ある蛋白は非常に大きな「コ」の字を時計回りに90℃回転させた感じになっておりますので、これを改善するためにはもしかしたら最初のstack gelに入るまでの泳動で何か間違っていないかなあと思うのですが、心当たりがありません。 引き続き、些細な事でも構いませんのでアドバイスいただけますと幸いです。

(無題) 削除/引用 No.3395-2 - 2010/10/22 (金) 13:05:56 - あべちゃん >[Re:1] nativeさんは書きました : > 1. native PAGE用ゲルの非連続ゲルの作製は基本的には購入するものなのでしょうか？ ペリスタとグラジェントゲルメーカーで自作してます。 > 2. 参考資料の中にはnative PAGEを行う場合、separation gelで十分でstacking gelは必要ないと書かれてあるものもありました。 いつも勾配ゲルの上に載せてます。スタックさせると言うより、勾配が崩れないようにコームを挿すには必要です。

native PAGE用の非連続ゲルを手製されておられますか？ 削除/引用 No.3395-1 - 2010/10/22 (金) 12:57:09 - native いつも拝見させていただいております。 この度、私の研究においてnative-PAGEを利用することになりました。 精製した興味あるタンパク質と別のタンパク質リガンドとの相互作用を検討しております。 labの経済状況からnative-PAGE用ゲルはCurrent protocol of molecular biologyに従って自作しております。ゲルは非連続ゲルで、separation gelの下から12 %->10 %->7.5 %->5 %です。 ミニゲル用で、まず12 % protogelを流し込み、イソプロを少し乗せて15 minほど固めては、また別の濃度のprotogelを流し込み固める、という操作をsequentialに繰り返しております。その後、stacking gelを乗せて30 min経ったものを使用しております。ゲルの作製に時間がかかるためまとめて３つほど作製し、使用しない分は4℃で保存して数日以内に使用しています。 精製した組替えタンパク質をこのゲルで泳動後PVDF膜へ転写し、tagに対する抗体で組替え蛋白のbandをみると、泳動パターンが毎回同じには成らず、ある時はstackingゲルとseparationゲルの間に挟まって全く泳動すらされない時や、bandが逆Uの字になったり、バーベルのようなbandになったりもします。 このforum内や、参考資料等を拝見し、ゲルの泳動を普段の30 mAから10 mAに落としゆっくり丁寧に泳動したり、sample buffer中のglycerolの濃度も下げてもみましたが、結果に再現性が伴うことはありませんでした。 長くなり申し訳有りません。 皆様にお聞きしたいことがあります。 1. native PAGE用ゲルの非連続ゲルの作製は基本的には購入するものなのでしょうか？ 2. 参考資料の中にはnative PAGEを行う場合、separation gelで十分でstacking gelは必要ないと書かれてあるものもありました。 これら２点に関して、みなさまのご意見をいただけますと幸いです。 ちなみに私は2. に関してはまだstack gelなしでは行ってはおりません。 どうぞ宜しくお願いいたします。

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