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(無題) 削除/引用 No.3387-12 - 2010/11/18 (木) 13:01:06 - Ia moiさん >>私もマウス心筋でTUNELをみていますが、正直言ってほとんど染まりません。正常心筋ではほぼゼロ、不全心でも私の場合は１％以下です。でもこれは、負荷の程度やストレインにもよるかもしれません。 DAPIか何かで共局在したものをカウントしていますか？ 私の研究室はほとんどTUNEL染色をした人がいないので試行錯誤を繰り返しているのですが． もし可能であるならmoiさんの条件をくわしく教えていただくことはできませんか？ >>文献では、TUNEL陽性細胞の頻度から、よく心不全でアポトーシスが増加している。という論調が多いですが、実際は1％以下の頻度であり、それで有意差がある、ないといっても、たまたま陽性細胞が視野にあったか、なかったかの偶然性に左右される面が大きい方法だと思います。 reviewでもTUNEL染色の結果が人によってかなりちがう（30%〜0.03%のTUNEL陽性細胞）ために議論されていました． >>仮に、心筋細胞で１０％もTUNEL陽性細胞があったら、あっというまに心筋すべてが全滅してしまうので、１％程度の頻度というのは、実際はかなり高頻度と思います。 なぜ１０％だと心筋全てが全滅してしまうという考えをお持ちなのでしょうか？私は逆にすごい少ない割合の心筋細胞がアポトーシスを起こしていてもさほど影響がないのでは？と思ってしまいます．なぜなら他の臓器，例えば脳では１０％よりもはるかに多く陽性細胞が確認されるためです．

(無題) 削除/引用 No.3387-11 - 2010/11/18 (木) 12:20:19 - moi 私もマウス心筋でTUNELをみていますが、正直言ってほとんど染まりません。正常心筋ではほぼゼロ、不全心でも私の場合は１％以下です。でもこれは、負荷の程度やストレインにもよるかもしれません。 文献では、TUNEL陽性細胞の頻度から、よく心不全でアポトーシスが増加している。という論調が多いですが、実際は1％以下の頻度であり、それで有意差がある、ないといっても、たまたま陽性細胞が視野にあったか、なかったかの偶然性に左右される面が大きい方法だと思います。 仮に、心筋細胞で１０％もTUNEL陽性細胞があったら、あっというまに心筋すべてが全滅してしまうので、１％程度の頻度というのは、実際はかなり高頻度と思います。しかし、繰り返しになりますが、たまたま撮影した領域に陽性細胞があったか、なかったかの偶然性が大きいので、caspase3など、他の方法でもアポトーシスを確認しておいたほうが良いように思います。 ちなみに、もし心筋梗塞の切片があるならば、それを染めると、梗塞領域はTUNEL陽性細胞がかなり多いので、参考になると思います。

(無題) 削除/引用 No.3387-10 - 2010/11/17 (水) 22:28:18 - Ia ぷれこさん，AAさん DNaseの件，教授に相談したところやっとの思いで買ってもらえそうです。 購入しましたら再度検討してみます．

(無題) 削除/引用 No.3387-9 - 2010/11/08 (月) 17:40:46 - ぷれこ うまくいっていないのなら、なおさら、DNaseを用いたポジコンを置くことをお勧めします。 ポジコンではTUNEL陽性細胞がはっきりと分かるはずです。 ポジコンでもTUNEL染色ができていないようでしたら、 あなたの手技か試薬の問題だということが とりあえず分かりますし、 ポジコンでうまくいけば、TUNEL陽性細胞とはどのように染まるものなのか、 今後の判断の助けになりますよ。

(無題) 削除/引用 No.3387-8 - 2010/11/08 (月) 10:22:03 - Ia >>念のため確認ですが、DNaseを用いたポジコンはおいてますでしょうか？ DNaseは用いておりません

(無題) 削除/引用 No.3387-7 - 2010/11/02 (火) 15:25:08 - AA 念のため確認ですが、DNaseを用いたポジコンはおいてますでしょうか？ 発色が行き過ぎてバックが上がってしまうならポジコンの発色具合を見ながら止めれば良いと思います。 もちろん、人為的に断片化していますのでサンプルの発色状況を再現しているわけではありませんが、心筋のように細胞死が頻繁に起きていそうではない組織においてはほとんど染まらないということも大いにありうると思われます。

(無題) 削除/引用 No.3387-6 - 2010/10/25 (月) 20:15:09 - T kitの取扱説明書通りで再度やってみましたが上手くいかなかったです 顕微鏡の扱いも初心者ですので必要最低限の技術しかまだありませんが、別の臓器の研究をしている人に見てもらったところTUNEL陽性細胞は無いといわれました。 今回はproteinaseK 20μg/mLを15分間作用させました。 しかし今回の結果ではバックグラウンドが高い気がします。 心臓でTUNEL染色を行うのは難しいのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3387-5 - 2010/10/25 (月) 20:10:47 - 通りすがり クエン酸バッファ＋熱処理での賦活化はパラフィン切片では良く使われる手法ですが、 パラフィン切片におけるTUNEL染色に対する一般的な手法はproK処理だと認識しておりました。 長時間処理するとバックが上がることは知られていますが、簡便なため、私もそちらで行っております。 AAさんのプロトコールでは、proK処理よりもシグナルが出やすいということでしょうか？ 興味がありますので差し支えなければ返信頂けると幸いです。

(無題) 削除/引用 No.3387-4 - 2010/10/25 (月) 18:14:54 - AA 私の所属する研究室ではPromegaのキットを使って、TdTの前に 0.5%Triton/PBSを10分＋10mMクエン酸バッファー90度湯煎30分で浸透化処理をしています。 組織はマウス脳ですが、これをしないとシグナルが弱くなり結果としてバックグラウンドが上がるまで発色させる羽目になりました。 パラフィン切片の場合、クエン酸バッファーで加熱処理するというのは比較的よく行われる浸透化処理かと思いますが、うまくいかないのであればプロトコル通りに一度やってみるのも良いかと思います。

(無題) 削除/引用 No.3387-3 - 2010/10/20 (水) 23:33:43 - T 早速のご意見ありがとうございます． APさんのおっしゃる通りです． kitのプロトコールに従ってやるべきでした． ただ私のラボでは心臓以外にもある臓器を用いており，そちらのプロトコールではTUNEL染色が上手く行くということからまずやってみたのが始まりです． APさんの言う通りでした．本当に反省いたします． 再度，製品のプロトコールに沿って検討させていただきます．

(無題) 削除/引用 No.3387-2 - 2010/10/20 (水) 23:04:48 - AP メーカーのプロトコールと違うのは何か意図があるんですか？ ttp://catalog.takara-bio.co.jp/product/tech_info_detail.asp?unitid=U100002973&masterid=M100002683 まず、メーカーのインストラクションに従って行って、モディファイするならその後じゃないでしょうか。 >抗原不活化のために10mMTrisodium Citrate Dihydrate(pH6.0)を電子レンジで沸騰させ，そこにスライドガラスを入れて５分間沸騰させる なにを賦活化しようとしているのですか？　別の抗体でカウンターステインでもするんですか？TUNEL法でアポトーシスを検出する原理は了解してるのでしょうね？ TUNEL法はアポトーシスで断片化した染色体DNA断片の末端をTdTで標識するしくみです。 >抗原不活化のために10mMTrisodium Citrate Dihydrate(pH6.0)を電子レンジで沸騰させ，そこにスライドガラスを入れて５分間沸騰させる こんなことしたら、アポトーシスと関係なくDNAが断片化してしまうんじゃないでしょうか。

心筋組織のTUNEL染色について 削除/引用 No.3387-1 - 2010/10/20 (水) 22:10:58 - T wistar系雄性ラットの左冠状動脈を結紮して心筋梗塞を作製後，エコーにより心機能低下を確認したラットの心臓を染色に使用しています． 心臓を摘出後，直ちにランゲンドルフ灌流装置に装着し，１０分間灌流後，５分間4%パラホルムアルデヒドで固定しています． その後心臓を輪切りにして4%パラホルムアルデヒドに浸けてovernight. 翌日，パラホルムアルデヒドを洗い流すために４時間流水したサンプルをパラフィン包埋しパラフィンブロックを作製しています． 切片作製後スライドガラスに貼り付け，３７℃でovernight. 翌日，１００℃の乾燥機に２０分入れたのち，直ちにキシレンに浸けて（５分）➔キシレン（５分）➔１００％アルコール（４分）➔９５％アルコール（２分）➔８０％アルコール（２分）➔７０％アルコール（２分）➔蒸留水 ＴＢＳＴに３０分浸ける 抗原不活化のために10mMTrisodium Citrate Dihydrate(pH6.0)を電子レンジで沸騰させ，そこにスライドガラスを入れて５分間沸騰させる 溶液を放冷（９０〜１２０分） ＴＢＳで洗い×３ TdT enzyme reaction solution(Takara) を９０分，３７℃，遮光で反応させる． このようなプロトコールで心臓の切片を作製しTUNEL染色を行っているのですが，TUNEL陽性細胞が見当たりません．一応TUNEL陽性細胞のようなものが見られるのですが，バックグラウンドが高く，もっと明瞭に見えないものかと考えております よろしくお願いいたします．

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